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结直肠癌的发生发展受相关调控通路中驱动基因集合（包括KRAS、NRAS、BRAF和PIK3CA在内）的共同影响，患者中携带有这四种驱动基因突变者约占40%~70%。随着靶向新疗法和最小残留病灶治疗策略的发展，对结直肠癌患者进行基因突变检测和长期监测的临床需求日益突显。在选用分子诊断技术时，除考量基本检测性能外，也更趋向于灵活、便捷、无创和经济实用。
数字PCR具有出色的检测灵敏度和特异性，在难以获得癌症组织或监测最小残留病灶的情况下，可利用液体活检标本中的微量检材对突变进行准确评估。但如何提升数字PCR的多重检测能力、扩大靶标通量，是限制其在临床诊治中广泛实施的一个瓶颈。
近年来，复旦大学附属中山医院检验科团队致力于液体活检检测技术的方法创新与改进。团队在2023年发表于《The Journal of Molecular Diagnostics》杂志（IF 4.1，JCR 2区）的研究工作中，基于多重drop-off数字PCR技术（multiple drop-off digital PCR，MDO-dPCR）针对结直肠癌开发出了解决靶标通量痛点的检测新方法。在该项工作中，研究团队进一步优化数字PCR检测方法的灵敏度与特异性，将基于振幅/比率的多重检测策略与drop-off检测策略相结合，最终仅以3个检测反应实现快速、经济、全面地筛查KRAS/MRAS/BRAF/PIK3CA基因上69种常见热点突变。其低成本、高分析性能及高覆盖度的优势鲜明，在对大量临床可操作突变进行全面检测的同时，最大限度地减少了患者标本的使用量需求，尤其适用于在液体活检样本量有限的情况下筛查突变。与二代测序技术相比，周转时间更快、成本更低，能胜任有限资源情况下关键预后生物标志物和治疗靶点的快速筛选，有力支持临床治疗决策。
该项研究将常规dPCR、单靶和双重drop-off策略灵活结合，分别设计了三种MDO-dPCR方案，分别用于KRAS、NRAS、BRAF和PIK3CA基因的热点突变检测。图1为探针设计原理及二维散点示意图。
单靶标反应（Simplex）展示了野生型基因组DNA（WT）和相应热点区域突变质粒混合物（MUT）经drop-off探针检测后的荧光信号簇分离情况。在drop-off策略下，每个探针使用两种不同荧光基团（FAM/HEX）分别标记突变热点区域的野生型序列（DO探针）及其相邻的不变区域序列（REF探针）。这样野生型序列所形成的单个扩增子可释放双阳性荧光信号（橙色）；当热点区域存在突变时，DO探针失去结合或呈次优结合，其FAM或HEX信号呈较低荧光振幅，表现为单阳性荧光信号（绿色或蓝色）。
在设计多重靶标反应的过程中（Multiplex），研究团队加入对探针浓度或荧光比的调节，影响不同靶标荧光信号的相应振幅/比率，产生二维坐标中一系列可分离辨识的独特荧光信号簇。
研究使用合成寡核苷酸对MDO-dPCR方法的检测性能进行了评估，证实其具有高度特异性，分析灵敏度<0.2%，达到了筛选低起始量样品所需的灵敏度水平。同时利用结直肠癌患者队列（n=106）的血浆cfDNA样本就MDO-dPCR与NGS方法检测结果进行了比较（图2）。106例患者个体经两法检测后92例结果相符，一致性达86.79%（图2A）。在队列中所有患者合计1060个可报告结果中，40个突变阳性结果和1003个突变阴性结果经两法同时检出，另外17个不一致的突变结果均处在低突变等位基因频率（mutant allelic frequency，MAF）水平，其中位MAF为0.63%，范围为0.26%~2.17%（图2B）。两法除显示出高度的结果一致性外，所检出MAF也显示出较强的相关性（图2C），两法平均MAF差异为2.77%（图2D）。
郭玮教授点评
该项研究工作展示了一种全面的MDO-dPCR检测设计思路，对于KRAS、NRAS、BRAF和PIK3CA中常见热点突变的检测仅利用3个反应就显示出了优越的分析性能，也经过临床队列研究证实了其临床有效性。
与NGS检测相比，MDO-dPCR的报告速度更快、成本更低，在资源有限的临床环境下也能快速支持治疗决策。它在开发策略上具有高度的通用性，适用于更广泛的临床场景。
郭玮，复旦大学附属中山医院检验科主任，博士、博士生导师、教授。长期从事肿瘤转移复发机制及检验新技术研究，揭示肝癌循环肿瘤细胞从原发灶释放到循环内生存新机制。现任中国医师协会检验医师分会副会长、中华医学会检验医学分会常务委员、上海市医学会检验医学专科分会候任主任委员、上海市医学会理事，《中华检验医学杂志》和《检验医学》副主编。
近年来主持国家自然科学基金4项，参与完成“十二五”国家科技支撑计划子课题、国家科技重大专项课题多项，荣获2020年国家科技进步二等奖（参与）、2022年上海市科委临床检验质谱专业技术服务平台、2019年度上海市科学技术奖一等奖（参与）、2019年度华夏医学科技奖，获2020年度“国之名医・优秀风范”荣誉称号。获得国家专利授权41项。在国内外统计源期刊发表论文190余篇，以第一作者或通讯作者在Clinical Cancer Research、J Hematol Oncol、Clinical Chemistry、Hepatology Research、BMC Cancer等杂志上发表SCI 90余篇。主编、参编专著20部。
