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近年来，重庆大学医学院罗阳教授团队致力于创建新方法、新技术用于外泌体及其内容物的检测。团队于Nature Index期刊《Analytical Chemistry》等杂志发表了系列高水平研究成果。该团队基于纳米诊断技术，开发基于多重适配体识别驱动的肿瘤外泌体相对丰度识别检测新策略，构建可用于肿瘤外泌体内microRNA保真检测新技术，进一步开发了基于脂质体膜融合的外泌体内miRNA检测新技术，实现肿瘤外泌体定量分析和内容物丰度检测，进一步为肿瘤早期检测诊断提供理论指导和技术支撑。
为了使信号单元具有适配体识别靶向功能又具有引发催化发夹组装反应的催化功能，构建了Aptamer-trigger序列，针对细胞外囊泡膜表面上的两种特异性蛋白EpCAM和CD63，因此以EpCAM trigger和CD63 trigger识别特异性的肿瘤特异性蛋白EpCAM和通用性细胞外囊泡标志性蛋白CD63，同时启动双重CHA自催化反应。首先，采用琼脂糖凝胶电泳验证了两套反应体系的可行性（图2a-b，d-e），进一步应用荧光检测技术验证其信号放大效果（图2c, f）。可见，联合了核酸适配体对CHA反应的trigger序列进行功能化，有效实现CHA反应的信号放大，成功构建具有识别功能的引发链启动对应的自驱动链置换反应。
图2 凝胶电泳实验验证具有识别功能的CHA信号放大体系的可行性
为探究所构建策略的检测性能，以乳腺癌细胞MCF-7来源的csEVs为模式囊泡（图3）。在制备不同浓度csEVs溶液后，利用前述的标准化检测流程，于最适反应条件下进行信号放大检测，测定反应体系的FAM荧光强度。随着溶液中csEVs浓度的增加，采集到的检测信号增强。同理，正常细胞来源囊泡的荧光随着sEVs浓度增加，体系中CD63信号增加。进一步分析两种囊泡混合后的检测比例，数据分析显示其荧光比值与浓度比例对数呈线性相关。临床样本分析显示，肿瘤分期患者越晚的患者，其相对的肿瘤外泌体量越高，本研究提出的肿瘤外泌体相对丰度PRc-exo/t-exo可作为揭示乳腺癌恶化程度的潜在指标。该策略能够有效避免肿瘤外泌体的检测损耗，采用相对丰度的指标进行评估，更能反映疾病进展情况。
图3 细胞及临床样本来源sEVs的检测
所设计的DNA纳米探针在三条探针端点部位标记荧光基团，在另一条带有识别检测探针的序列一端标记淬灭基团，在靶标microRNA存在的情况下，与四面体探针顶点部位延伸的发卡序列相结合，从而打开发卡结构，使得淬灭基团和荧光基团的距离增加，淬灭效应消失，荧光基团恢复正常发光。在检测探针体系中，图5结果表明，所设计的四面体探针具有良好的靶标microRNA识别效果，同时具有一定的浓度识别效应。并且检测探针具有良好的检测特异性，有利于其在复杂样本中靶标miR-21的识别检测。
图5 fLIGHT检测探针与靶标序列的直接识别检测效果
进一步fLIGHT能够保持几何形状稳定的同时具有良好的穿透力，为验证fLIGHT探针无损进入sEVs，构建蛋白芯片验证其能够保持sEVs膜完整的同时进入sEVs实现胞内miRNA的检测，见图6。同时显著区分了临床肺癌患者和正常人血浆中sEVs内miRNA丰度，对比传统方法RT-qPCR具有良好的一致性。
进一步团队构建一种脂质体膜融合无酶检测（LIFE）方法用于单个外泌体miRNAs的检测。该研究发表在《Materials Today Bio》（2023 IF：10.761，中科院一区），题目为“Liposome fusogenic enzyme-free circuit enables high-fidelity determination of single exosomal RNA”。该体系利用载有探针的阳离子脂质体捕获单个目标外泌体并与之融合，从而实现探针递送和由目标生物分子启动的原位级联信号放大，通过精细控制引入LIFE探针的比例可以准确测定单个外泌体中的痕量内容物（图7）。该技术方法可在不破坏囊泡完整性的情况下高保真地测定单个外泌体miRNAs，能够促进疾病早期诊断和个性化治疗的发展。
在成功制备脂质体的前提下，以1:1的摩尔比孵育CFLs和外泌体来诱导单个外泌体融合。如图8所示，通过NTA显示了其融合过程，TEM图像及NTA粒径显示其粒径增大（160.4 nm）。在对融合过程中完整膜的表面积进行评估后，推断CFL倾向于以1:1的摩尔比融合单个外泌体。通过FRET稀释后供体放射恢复及Zeta电位的测量，对CFLs和外泌体融合的动力学分析，聚乙二醇和静电吸引发了CFLs和外泌体的融合。
图8 CFLs与外泌体的膜融合
同时，分别设计了具有茎环发夹的H1和H2，可以通过催化发夹组装进行扩增反应。如图9凝胶电泳结果显示，miR-122能够打开H1发夹，并进一步诱导H2发夹的打开，在CHA-DNAzyme反应启动后，H2中的RNA位点被成功切割进而启动循环扩增，荧光强度增强，实现miRNA-122高灵敏特异性检测。
进一步，从肝细胞系中提取外泌体，并制备DNAzyme-CFLs体系。利用共聚焦荧光显微镜探索了所提出的CHA-DNAzyme探针负载效率和外泌体-CFL融合能力及检测能力，图10结果表明其可精准检测到目标miRNA。并在HepG2细胞中过表达和下调表达miR-122后提取外泌体进行检测，LIFE平台可以有效区分miR-122的表达量。最后应用提出的LIFE平台检测肝细胞癌(HCC)患者和健康供者血清中的外泌体mir -122。分别从10名HCC患者和10名健康人身上采集了4 mL抗凝血，并从他们的血浆中分离出外泌体。该检测系统可以很好地区分肿瘤患者和健康个体血浆外泌体中miRNA的丰度。
图10LIFE方法检测外泌体miR-122及临床肝癌患者血浆外泌体miR-122
本研究提出了一种可靠高保真的LIFE方法，用于检测外泌体内容物，而不会破坏保真结构，具有高灵敏、高效简便的特点。这项技术为高保真检测单个外泌体内容物提供了新策略，这对研究外泌体内容物的分子机制及其潜在的诊断治疗应用具有重要意义。
肿瘤外泌体是液体活检的重要检测靶标。现有的肿瘤外泌体富集分离及检测技术难以适应外泌体检测及应用的技术研究和市场需求。我们通过整合功能化纳米检测技术，分别提出肿瘤外泌体筛选检测和内容物分析研究体系，构建基于肿瘤外泌体的全体系分析平台，用于常规环境中的外泌体快速、准确检测分析。随着DNA功能化纳米探针技术的发展和应用，本研究为外泌体的识别检测分析提供全体系分析技术，为液体活检的发展和应用提供技术支撑和应用指导。
系列成果依次下载链接：
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.2c01683
https://doi.org/10.1002/smll.202002800
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC10060373/
罗阳教授简介
