作者：周丽
单位：河南省信阳市中心医院医学检验科
PCR技术具有高敏感性、特异性强的优势，少量样本就可以检测，在临床检验中应用越来越广泛，因为PCR是以几何级数扩增，稍差分毫，就会十分影响扩增结果，所以我们在实验过程中要格外注意各个步骤的操作细节，有哪些细节是容易被我们忽视的呢？
一、移液器的正确使用
拉倒吧，谁不会用移液器。那细节您真的注意到了吗？
首先，如何选择量程。10uL的液体您如何选择量程？一般来说，10uL的液体最好选择10uL、20uL的量程，50uL、100uL的就不太合适。有数据表明，在移液器量程值的百分之三十到一百都是非常精确的，如100uL量程的移液器吸取30-100uL的液体误差较小、精确度高，而吸取10uL的液体误差就会增大。
其次，吸取液体时插入液面多少为宜呢？我比较常见到的是一插到底或者在液体正中间吸取。正确的操作是：如果是微量移液器最好在液面下1-2毫米处吸取为宜，而大量程的移液器最好在液面3-6毫米，然后枪头随着液面下降也相应往下移动。枪头位置太浅易吸入空气，造成实际吸液量变少；太深，一方面枪头外壁挂壁太多，造成实际吸液量过多，另一方面液体压强对枪头内部空气过度挤压，也会造成实际吸取液量过多。
接着，很多人有在正式吸取液体前先试吸取两三次，使枪头内壁“湿润”一下的习惯，这样确实可以让吸液量更准确。但是，如果是在冰盒上吸取液体，“湿润”枪头反而会影响准确性，所以冰盒上使用移液器，您就直接吸。
最后，有时候移液器需要伸入到较长样本管内吸取，一定注意避免污染移液器，每加一个样本可以用无尘纸擦拭一下移液器，加样结束后再用75%的酒精擦拭。
二、配置各种试剂时的细节
为避免反应试剂的反复冻融，我们可以分装后冷冻保存。一次分装较多时，最好中间更换枪头，避免枪头松动造成吸液量不准。
有些比较粘稠的试剂，我们除了可以采用慢吸慢打的方法，还可以采用减排法（按压到二档吸液，然后一档排液）。
三、手工提取核酸时的细节
柱提法提取核酸，最后一步洗液去除后，再次空离很重要，不能省，换了新收集管后先不着急加洗脱液，打开盖子晾几分钟，让无水乙醇挥发掉，有的提取试剂盒没有这一步，但是最好打开盖子晾几分钟，让无水乙醇挥发掉；洗脱液一定要加在膜的中央，不要靠着侧壁打出洗脱液，这种加法不能让提取的核酸充分溶到洗脱液里。同时为避免污染最好每次加样都更换枪头。
手工磁珠法提取核酸，加磁珠时一定要混匀，因为磁珠有一定重量，易沉底，如果标本比较多，最好每加几个后就振荡混匀一下。
四、加核酸
要保持吸液速度的一致性和打入反应试剂里的均一性。有的同事吸液速度一会快一会慢，转到反应试剂时有的是贴壁打，有的伸到液面以下打，没有哪种加样方式更好，保持均一性就可以了。八排管和盖子要匹配且要盖紧；加完样顺离后，要保证八排管内液体没有气泡。
五、上机
如果不能及时上机检测，最好把八排管放在冰盒上。为避免污染可以把冰盒套上塑料袋，或者用完的枪头盒里装上冰，上面直接放八排管，非常方便。如果上机样本不多，避免选择四周的孔位，避免受热不一。
注意了这些细节，您的PCR实验一定顺利！
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