背景介绍
唯比君在8月底发布的《光谱共焦显微物镜设计》，大家讨论度很高，接下来我们做几期共聚焦方面的内容，让大家有个更为深入的了解。本期我们先来深入浅出地了解下共聚焦显微镜的实现逻辑。
常规宽场显微镜
常规的显微镜在光路设计上，相机采用面阵CCD或CMOS，对应到物方拥有较大的观测视场区域。![]()
为了确保能观测整个视野区域，照明光要完全能够覆盖住成像镜头的视野范围，我们观察视野范围中某个焦点位置，焦平面前后一定深度范围的离焦区域的散射光混叠观察点位的散射光，显著降低了图像的信噪比。![]()
在生命健康领域，我们希望显微镜不仅仅看到当前的平面，而且希望能在深度方向上进行扫描观察，进行样品的组织切片观察分析，生物组织对不同光线具有非常强的散射，并且显微镜的景深和物镜的数值孔径平方成反比，通常生物显微镜为了获得更大的放大率，对应物镜的NA也比较大，导致系统的景深也很浅。通过上述分析可知，宽场显微镜显然不能满足生物组织切片观测分析的需求。
共聚焦显微的技术原理
科研人员提出，如果把样品上的照明点压缩到很小的范围内，这样观察点临近的位置噪声就会大幅降低，比如用针孔视野来代替常规显微镜的宽视野，临近位置的噪声光就在物理结构上被大幅隔离去除掉，从而显著提升了显微图像的对比度。共聚焦显微镜的具体光路结构如下图所示，我们在光源前面放一个针孔确保出射是一个点光源，并且光源针孔的位置和样品观察点是物像共轭关系。同理探测器前面也放一个针孔，探测针孔的位置和样品观察点是物像共轭关系。在光路中引入分光片，这样就能把光源激发光路和信号探测光路分离开。
当观测样品对焦时，正好成点像，通过探测器针孔接收能量；当观测样品离焦时，对应到探测器位置光斑已经弥散开，能够通过针孔的光能量非常低，这样就保证了只有焦面位置对应最大能量。从上述分析，共聚焦三个字的意思就呼之欲出：点光源通过物镜恰好和观测点聚焦到焦平面上同一个位置。共聚焦显微镜这套技术原理，是1957年Marvin Minsky在哈佛大学研究期间提出的，下面是Minsky描绘的原理图，大家有兴趣可以查阅专利。单点扫描共聚焦
基于共聚焦显微镜的技术原理可知，单次只能对一个点成像，要获取宽视野的测试数据，必须要进行扫描成像。下图是基恩士共聚焦测量显微镜的结构示意图，载物台可以在XY方向移动扫描，显微镜系统是被安装在可以沿Z轴上下移动扫描的AF机械臂上。通过XYZ三轴移动扫描，就获取了样品的3D测试数据。![]()
点扫描测量的效率实在太低了，因此演化出了多点扫描方式，比如在靠近光源侧放置转盘，盘面上排列着很多针孔，靠近样品的盘面上则相应地排列着同样数目的微透镜阵列，可以在同一时间对样品进行多点同步成像，如果针孔编码方式得当，相机配合转速进行同步开关曝光，就不需要在XY平面进行线性移动扫描，只需要沿Z轴进行深度扫描即可，扫描效率提升了好几个数量级。为了方便大家理解这个扫描方式，我们来做个简单的分解，显微物镜覆盖的视野在下图中的扇形区域内，为了规避掉各个点之间的能量串扰，点和点之间的距离不能太近，我们沿着扫描圆的径向分布针孔，让针孔在径向上cover住视野的宽度，然后随着转盘的转动，就能实现同时在径向和圆周方向对样品进行采样扫描。1967 年，David Egger 和 Mojmír Petráň通过螺距恒定的阿基米德螺线排列，制造了首台转盘共聚焦显微镜，测量效率比最初的尼普科夫圆盘高几百倍。下图演示了圆盘旋转时，针孔旋转到新位置以照亮整个样本。由于人眼的暂留时间很长，因此转盘显微镜的图像不仅可以通过相机拍摄，也可以通过目镜进行人眼目视观察。本文介绍了共聚焦显微镜的技术原理和扫描方式，希望帮助大家对共聚焦有个更深入的了解，如果大家想要了解更多商用共聚焦显微镜的信息，建议去Zeiss，Leica等制造商的官网进行指标参数查询说明。
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