华中农业大学国家重点实验室袁猛组 | 水稻白叶枯病菌及细菌性条斑病菌培养及接种
学术
科学
2025-01-01 07:30
北京
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水稻白叶枯病由稻黄单胞菌稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)引起，自然条件下由水稻的伤口或水孔侵入水稻叶片，进入木质部进行繁殖，由叶片向叶鞘侵染，最终造成叶片枯萎。水稻细菌性条斑病由稻黄单胞菌稻生致病变种(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola, Xoc)引起，自然条件下由水稻的气孔或伤口侵入水稻叶片，病斑起初为暗绿色水渍状，沿叶脉扩展呈细线状，严重时同样造成叶片枯萎。本实验介绍了这两种细菌的培养、接种及调查方法。关键词：水稻白叶枯病菌 水稻细菌性条斑病菌 细菌培养 接种 病情调查
4. Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo5. Xanthomonas oryzae pv. oryzicola, Xoc6. Tryptone (Oxoid, England, catalog number: LP0042)7. Agar (武汉创新生物技术有限公司，中国，catalog number: BM0212)8. Na2HPO4·12H2O (国药集团化学试剂有限公司，中国，分析纯)9. Ca(NO3)2·4H2O (国药集团化学试剂有限公司，中国，分析纯)10. NaCl (国药集团化学试剂有限公司，中国，分析纯)11. KCl (国药集团化学试剂有限公司，中国，分析纯)12. KH2PO4 (国药集团化学试剂有限公司，中国，分析纯)13. 蔗糖 (国药集团化学试剂有限公司，中国，分析纯)14. 甘油(国药集团化学试剂有限公司，中国，分析纯)1. 取出于-70 °C保存的菌株，于超净工作台上用灭菌枪头吸取菌液至土豆斜面培养基上，用灭菌接种环涂布均匀。2. 置于28 °C温箱内培养3天，细菌长成亮黄色，可将其置于4 °C存放一个月，使用时按照步骤1中所述方法将其转接至新的培养基上。3. 再次转接后的生根管置于28 °C温箱内培养2天，细菌长成亮黄色，可用于保存菌株或接种实验。上述步骤3中培养好的菌体，若需长久保存菌株时，向生根管中加入10-30 ml灭菌的30%甘油，与菌体混匀后，分装至灭菌的0.5 ml离心管中，置于-70 °C长久保存。1. 菌体于28 °C温箱内培养2天长成亮黄色后，用PBS溶液稀释，采用比浊法将浓度稀释至约9 x 109个细菌/ml。2. 接种采用剪叶法，于水稻孕穗期接种 (也可于水稻幼苗期接种)。接种时用剪刀蘸取菌液，剪去剑叶 (幼苗期接种时选取完全伸展的叶片接种) 叶尖约2 cm长部分。每个单株至少接种5片剑叶。3. 通常在接种14天或21天后进行调查。调查时量取病斑长度及病叶长度，依据病斑面积 (病斑长度/病叶长度) 衡量病情。每个单株至少调查5片剑叶。2. 接种采用渗透法(视频1)或针刺法(视频2)，于水稻幼苗期或孕穗期接种。幼苗期接种时选取完全伸展的叶片接种，孕穗期接种时选取剑叶接种。采用渗透法接种时，用一次性注射器吸取菌液，将注射口按住叶片，用力推动注射器，使菌液通过压力渗入叶片内。采用针刺法接种时，用一次性注射器吸取菌液后，将注射口装上针头，推动注射器使针孔中充满菌液，之后将针头刺入叶片，菌液随针头被带入叶片内。3. 通常在接种14天或21天后进行调查。调查时用刻度尺测量病斑长度，每个单株至少测量5片剑叶并取其平均值作为该单株的发病长度。(图1)
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图1. 水稻白叶枯病及细菌性条斑病接种结果示意图
1)温度为25-30 °C、湿度高的环境容易发病，温度过低或过高、空气湿度过低时发病情况差。因此接种时应留意环境条件的变化。2)接种应在可控制的条件下进行，避免造成病菌扩散，导致疫情。3)水稻细菌性条斑病为全国植物检疫性病害之一，应慎重接种。加蒸馏水至1 L，调pH至6.8-7.0，分装至生根管中，封口后灭菌，趁热将生根管倾斜待培养基凝固，使培养基在生根管中形成斜面。加入灭菌去离子水至终体积为1 L，用NaOH或HCl调节pH至7.4。马海港, 袁猛. (2018). 水稻白叶枯病菌及细菌性条斑病菌培养及接种. Bio-101: e1010180. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010180.
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