华中农业大学国家重点实验室欧阳亦聃组 | 水稻原生质体的分离及转化
学术
科学
2025-01-04 10:16
北京
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关键词：原生质体 黄化苗 酶解
2. 各种型号枪头 (所有与原生质体接触的枪头都要剪去尖头)注：将中花11种子按照组培方法于生根培养基中发芽，28 °C暗培养10-15天。少于10天的黄化苗叶鞘很短，细胞太小，不利于观察；而大于15天的黄化苗叶鞘由白色转为略带褐色，细胞太老，原生质体转化后活细胞很少。注：CsCl梯度离心纯化的质粒，或者QIAGEN plasmid Midi Kit (Catalog number: 12143)纯化的质粒10. Cellulose RS (Yakult Honsha)11. Macerozyme (Yakult Honsha)20. 2 M Mannitol (Sigma, FW: 182.17) (见溶液配方)21. 0.2 M KCl (Sangon, FW: 74.55) (见溶液配方)22. 1 M CaCl2 (BBI, FW: 147.02) (见溶液配方)23. 0.5 M MgCl2 (Sigma, FW: 95.21) (见溶液配方)24. 1.54 M NaCl (BBI, FW: 58.44) (见溶液配方)25. 0.1 M MES KOH, pH 5.7 (见溶液配方)26. MES hydrate (Sigma, FW: 195.24) (见溶液配方)27. 酶解液 (Enzyme solution) (见溶液配方)1. 配制酶解液，现配现用(见溶液配方7)，同时准备0.6 M Mannitol (溶液配方1)。2. 将酶解液倒到大小合适干净的培养皿中。将暗培养10-15天的黄化苗取出，将叶鞘浸在0.6 M Mannitol中，用锋利的刀片快速切割叶鞘成1 mm以下的小段，越细越好，不要撕扯。切下的叶鞘立即转入配好的酶解液中。一般50棵黄化苗的叶鞘用10 ml酶解液酶解，可至少转化5个质粒组合。更多的转化可扩大相应反应体系。叶鞘切完毕，泡在酶解液中，抽真空5-10 min，使大部分叶鞘下沉到酶解液底部。将酶解液用锡纸包被以避光，放置在28 °C，40-50 rpm的摇床上，酶解4-5 h。酶解完成后，取一滴酶解液镜检，如果细胞圆而发亮，则健康，继续往下做；如果细胞扁且发黑，则弃去。3. 酶解将近完成时，配制W5 solution及MMG solution (见溶液配方8及9)4. 将酶解液混匀，用150目的筛子过滤到新的培养皿中，再转移至10 ml圆底离心管中。100 x g转速，加速、减速加速度为2，离心10 min，并预冷MMG溶液。5. 用1 ml移液枪吸走上清，可见到管底有较多黄绿色沉淀，此为健康的细胞；如果沉淀很少，或者沉淀很白，则细胞质量不好。缓缓加入4 ml W5溶液，轻轻混匀，再以100 x g转速，加速、减速加速度为2，离心10 min。6. 用1 ml移液枪吸走上清，缓缓加入4 ml预冷的MMG溶液，以4 °C，100 x g转速，加速、减速加速度为2，离心10 min。7. 用1 ml移液枪吸走上清，缓缓加入2 ml预冷的MMG溶液，轻混匀，以4 °C，100 x g转速，加速、减速加速度为2，离心10 min。计算需要原生质体的体积：200 μl x N，再多留500 μl。用移液枪吸走上清，用所需体积的MMG溶液混匀原生质体，冰浴30 min。8. 在冰浴期间准备：将需要转化的质粒稀释成20 μl，质粒的量为2-10 μg，加到2 ml圆底离心管中。将离心机转头换成2 ml的小转头，温度设定为室温。9. 配制40% PEG4000溶液 (见溶液配方10)。10. 将原生质体混匀，依次向2 ml离心管中 (已加入了20 μl质粒) 加入200 μl原生质体和220 μl 40% PEG4000溶液，立即轻柔上下颠倒混匀并计时。室温放置20 min。11. 向2 ml离心管中加入1 ml W5溶液，混匀，室温100 x g转速，加速、减速加速度为2，离心10 min。用1 ml移液枪小心吸走上清，再加1.5 ml W5，28 °C暗培养12-16 h (不要短于8 h或者超过24 h)。12. 观察前，以室温，100 x g转速，加速、减速加速度为2，离心10 min。吸走上部液体，仅留底部200 μl细胞。轻轻混匀，在Confocal显微镜下观察荧光。1. 2 M Mannitol (Sigma, FW: 182.17)36.434 g加ddH2O定容至100 ml，微波加热溶解2. 0.2 M KCl (Sangon, FW: 74.55)3. 1 M CaCl2 (BBI, FW: 147.02)4. 0.5 M MgCl2 (Sigma, FW: 95.21)5. 1.54 M NaCl (BBI, FW: 58.44)称取MES hydrate (Sigma, FW: 195.24) 1.952g加ddH2O溶解，加KOH调至pH 5.7，定容至100 ml酶解液(Enzyme solution，现用现配)Enzyme solution (终浓度) 10 ml所需母液0.6 M Mannitol 3 ml 2 M Mannitol10 mM MES (pH 5.7) 1 ml 0.1 M MESCellulose RS (1.5%) 0.15 gMacerozyme (0.75%) 0.075 g搅拌溶解，55 °C加热10 min，自然冷却，再加入以下试剂
1 mM CaCl2 10 µl 1 M CaCl2154 mM NaCl 10 ml (1.54 M NaCl)125 mM CaCl2 12.5 ml (1M CaCl2)5 mM KCl 2.5 ml (0.2 M KCl)2 mM MES (pH 5.7) 2 ml (0.1 M MES, pH 5.7)MMG solution终浓度 100 ml所需母液0.6 M Mannitol 30 ml 2 M Mannitol15 mM MgCl2 3 ml 0.5 M MgCl24 mM MES (pH 5.7) 4 ml 0.1 M MES(pH 5.7)*注：W5和MMG平时存放于4℃冰箱，只要没有被细菌或真菌污染，就可以继续使用。0.6 M Mannitol 1.5 ml x 2 M Mannitol100 mM CaCl2。 0.5 ml x 1 M CaCl2PEG需要用微波炉稍微加热溶解，混匀，在转化前放在37 °C温箱中保温，防止其再次凝固江云鹤, 程珂, 赵晓波, 欧阳亦聃. (2018). 水稻原生质体的分离及转化. Bio-101: e1010125. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010125.
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