为了让使用iPS细胞（诱导性多能干细胞）的再生医疗更加贴近现实，需要以低成本、稳定地大量生产iPS细胞。尽管悬浮培养法是一种具有潜力的方法，但其自发分化概率高于使用培养皿等进行的贴壁培养法，这一问题成为了该技术的瓶颈。由日本理化学研究所生物资源研究中心iPS细胞高维表征分析开发团队的团队负责人林洋平、开发研究员高崎真美、京都大学iPS细胞研究财团研究开发中心、KANEKA再生与细胞医疗研究所等组成的合作研究团队，成功地开发出了一种能够在抑制自发分化的同时实现大规模培养的技术，并实现了能达到实际应用水平的大量培养目标。团队负责人林洋平表示：“由于只需加入两种阻断分化诱导信号的化合物即可直接使用现有的市售培养液，培养成本只有以往的几分之一。我们将致力于推动该技术的临床应用。”
理研的团队负责人林洋平（供图：科学新闻社）
贴壁培养法因其能轻松在显微镜下观察单个细胞，并保持细胞的锚定依赖性，因此适合学术研究室使用，但难以进行大量培养，也不适合自动化。而悬浮培养法因易于大量培养并能够自动化，是一种适用于产业化再生医疗的方法，但在培养过程中容易出现自发分化的问题。
研究团队通过实验比较了相同培养液条件下贴壁培养和悬浮培养的情况，发现贴壁培养中仅0.01%的iPS细胞表达了分化标志物，而悬浮培养中这一比例约为3%。
为了解决这一问题，研究团队探索了能够阻断参与初期分化的信号的化合物，发现针对中内胚层分化，联合使用Wnt抑制剂可有效抑制，针对外胚层分化，需使用PKCβ抑制剂。团队负责人林表示：“我们已经知道阻断Wnt信号可抑制中内胚层分化，而对于外胚层，我们尝试了多种化合物，结果发现只有PKCβ抑制剂能达到效果。”
研究团队在添加了两种抑制剂的悬浮培养条件下，在生物反应器中对临床用iPS细胞株进行了大量培养。并且每隔3至4天更换一次新的培养基，连续传代3次，实现了平均每次制备约300管、每管约含100万个细胞的冷冻管。然后，对每次制备的部分冷冻管进行解冻播种后，并对由此大量培养的iPS细胞实施特性评估后结果表明，大量生产的iPS细胞保持了自我复制、多能性、核型（染色体构成），特性不逊于传统贴壁培养条件下的细胞，并且这些细胞在诱导分化为多巴胺能神经前体细胞、心肌细胞、肝细胞等对再生医学和新药研发有用细胞类型时，其分化诱导效率也未发生改变。
此外，研究团队还进一步在相同悬浮培养条件下，成功地实现了利用人外周血单核细胞建立iPS细胞、筛选单细胞扩增克隆株、保持自我复制特性进行长期培养、从悬浮培养直接冷冻保存和从直接解冻开始悬浮培养、临床级人类iPS细胞株高效大量培养等一系列培养过程。
团队负责人林洋平表示：“我认为这项成果可以为实现利用人类iPS细胞的自体细胞医疗做出贡献。此次研究的部分内容是在合作研究单位——京都大学iPS细胞研究财团研究所进行的，明年该研究所将会开展制备iPS细胞库等实用化工作。”
原文：《科学新闻》
翻译：JST客观日本编辑部
【论文信息】
期刊：eLife
论文：Complete suspension culture of human induced pluripotent stem cells supplemented with suppressors of spontaneous differentiation
DOI:10.7554/eLife.89724
