NCBI查找基因序列
以human p53 为例进行引物设计，p53在human中的基因名为TP53。
打开NCBI网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/），数据库选择Gene，搜索框输入“TP53 human”，点击Search。
检索结果第一条就是我们要找的TP53 基因，点击进入下一页面。
点击右侧边栏的NCBI Reference Sequences (RefSeq)查看序列信息。
点击【NM_000546.6】进入下一个页面。
往下翻，找到【CDS】，点击进入下一个页面。
如下页面点击右下角【FASTA】。
下面框出来的就是我们需要的p53基因序列，复制序列信息。
Snapgene设计引物
打开Snapgene软件，菜单栏选择文件--新建DNA或RNA文件。
Snapgene 6.02（可切换中文版）安装包，可以在科研根号三公众号，回复“软件60”下载！
把在NCBI复制的序列粘贴到新建文件内，选择【可以】--【添加】。
点击底部的序列按钮，可以切换到序列窗口。
2.1 设计引物的原则
1）引物长度一般在18-35碱基对。
2）G-C含量控制在40-60%左右。
3）避免近3’端有酶切位点或发夹结构。
限制性酶切位点统计工具可以统计常用限制性酶切位点的数量和位置。使用此工具可以快速判断某限制性内切酶是否会切割目标DNA。（https://www.detaibio.com/sms2/rest_summary.html）
4）如果可能避免在3’端最后5个碱基有2个以上的G或C。
5）如果可能避免在3’端最后1个碱基为A。
6）避免连续相同碱基的出现，特别是要避免连续的GGGG或更多G出现。
7）退火温度Tm控制在 58-60℃左右。引物设计软件都可以给出Tm，引物长度，碱基组成，引物使用缓冲的离子强度有关。
长度为25mer以下的引物，Tm计算公式为：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)
对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size
公式中，Size = 引物长度。上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。
8）如果是设计点突变引物，突变点应尽可能在引物的中间。
2.2 设计上游引物
选中18-35碱基对，选择过程中可以看到碱基对数和Tm值、GC占比量。
选择好碱基之后，菜单栏--添加引物--顶部链--添加引物到模板。
上游引物选择“顶部链”，下游引物选择“底部链”。
2.3 设计下游引物
也是按照上游引物设计一样的方法。
2.4 检查上下游引物
点击左下角“引物”，检查引物是否符合引物设计标准。
如果不符合，可以去除引物重新设计，直到符合条件为止。
验证引物
设计完引物之后，可以先对引物进行检查，是否特异性。
引物是一段短的单链寡核苷酸，在PCR过程的退火阶段，引物与单链模板结合，DNA聚合酶沿着引物的3’末端向后进行DNA的合成。引物与模板的结合遵循碱基互补配对的原则，因此，当退火温度不合适或引物设计不合理时，引物会结合到模板的非目标区域，从而导致其他片段的扩增。
所谓引物特异性，就是引物结合模板正确位置的能力，或者避免结合非目标位置的能力。引物的长度、GC含量、碱基分布、Tm值等性质，均会影响其特异性。
我们可以使用NCBI的Primer-BLAST进行引物验证。https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
在Primer Parameters 板块，将上下游引物序列粘贴进去，5’-3’方向。产物大小默认为70~1000，可以根据实际情况进行调整。
选择相应的物种和参考数据库。
首先，要确保Specificity check一栏中已经打勾。Search mode一般选择Automatic即可。
物种：人源的基因选择Homo sapiens(taxid:9606)；小鼠的选择Mus musculus (taxid:10090)；大鼠的选择Rattus norvegicus(taxid:10116)。
参考数据库：要看PCR的模板是什么，如果是提取的RNA反转录后得到cDNA就选择Refseq mRNA（针对mRNA）或Refseq RNA（针对mRNA和lncRNA）；若模板是基因组，则应该选择Refseq representative genomes。在Exclusion行中，可以对预测的序列以及环境/不可培养样本序列的干扰。
选好数据库和物种后点击页面左下角的Get Primers，系统进行分析，一段时间后会进入如下产物预测页面。（需要耐心等待一会才能加载出来）
结果包含比对出来的基因结果、预测产物大小、正反向引物和模板的结合形式，“点”代表该位置的序列和模板完全互补配对。
注意看分析结果中是否会匹配到同物种或不同物种的其他基因，其他基因预测，虽然并非完全匹配，但是也可能出现杂的产物。后期需要控制延伸时间，避免这种长片段杂产物的出现。
如果是非特异性，会出现如下图所示结果：红框位置并非是“点”，而是碱基，说明该位置跟模板不匹配，这种属于潜在的非特异性扩增结果。
但是，并不是说预测出了非特异结果，引物的性质就一定不好，需要具体情况具体对待：首先，引物的3’端对扩增效率的影响是非常大的，如果预测出的非特异性结果中，3’端存在不匹配碱基，说明即使引物能够结合模板，但3’端会翘起，导致无法扩增，这一类的非特异结果可以忽略。其次，PCR的产物大小是有限制的，尤其对于qPCR，由于延伸时间非常有限，大于1000的产物是基本上无法扩增出来的，如果非特异性产物远大于目的产物大小，这种非特异性结果也是可以忽略的。
当然，一对引物究竟好不好用，最终还是要通过实际实验来验证。Primer-Blast比对引物特异性的意义只能给到一个参考作用。
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