导语 .
当前，生命科学正在步入单细胞时代。单细胞技术在脑科学领域的应用正在掀起一场革命，帮助研究人员深入理解神经系统的复杂结构和功能。传统的基因组学和转录组学方法往往无法准确描绘每个细胞在大脑中的独特角色，而单细胞测序技术则能够揭示单个神经元和其他脑细胞的基因表达特征。这种细致入微的分析不仅增强了我们对大脑发育、功能及其疾病状态的认识，还为治疗神经退行性疾病、精神障碍等提供了新的思路和靶点。今天，我们就寻因生物已有的单细胞测序及单细胞空间转录组在脑科学中的应用提升进行详细讨论。
11月19日下午《国自然前沿-脑科学课题设计经验及创新技术机遇分享》做了详细的介绍。国自然宝典纸质版和视频回看可添加小寻领取：
我是小寻
01
脑科学研究现状
脑细胞是研究脑科学的基本单位，其功能由其基因表达所决定。想要了解神经细胞类型的分子表达需要对成千上万的基因进行定量，以此来找到细胞之间的差异。在单细胞测序出现之前，脑组织中RNA和DNA分析主要是进行bulk测序，最终获得的是组织中所有细胞的平均表达结果，致使一些罕见的细胞类型信号丢失。而单细胞转录组测序能够获得每个细胞的RNA表达情况，而单细胞表观基因组测序则能检测DNA甲基化，染色质可及性，染色质构象[1]。而空间转录组的加入，为我们理解大脑的细胞组成、功能区域、病理变化等提供了新的视角和深入的见解。随着技术的不断发展，预计该领域将在未来获得更多突破，推动脑科学研究向更深入的方向发展。
02
单细胞转录组及空间转录组在脑科学的应用
1. 细胞类型鉴定
单细胞技术的出现让我们解析大脑的细胞类型更加容易。早在2016年，单细胞测序就应用在表征脑细胞类型的组成[2]，近几年来有研究解析了来自小鼠中央神经系统和外围神经系统的120万个细胞，最终鉴定了379种不同的细胞类型，而这仅代表成年小鼠脑细胞数目的1%，说明在皮质下的区域仍然需要进一步探索[3]。而在人类大脑中，拥有的神经元数目多于小鼠1000倍，解析所有的细胞类型是一项巨大的挑战。近年来，已有很多研究学者将snRNA-seq应用到人类大脑的多个区域，构建了细胞类型分类谱系（图1）。同时scRNA-seq也已应用到非哺乳动物的脑中，包括发育、细胞调节、衰老等领域。其中在果蝇脑细胞中，通过单细胞测序构建了成年黑腹果蝇大脑细胞图谱，通过SCENIC的基因网络分析揭示了与能源消耗相关的调节异质性，发现在衰老过程中，RNA 含量呈指数级下降，而不会影响老年大脑中的神经元身份 [4]。在斑马鱼脑中，单细胞转录组学揭示了斑马鱼的神经干细胞/神经胶质细胞异质性，不同的神经干细胞群体会受到淀粉样蛋白毒性的不同影响，发现斑马鱼通过在淀粉样蛋白-β-42 （Aβ42） 诱导的实验性阿尔茨海默病 （AD） 模型中诱导 NSC 可塑性来再生大脑[5]。单细胞虽然解决了细胞异质性的问题，但在单细胞悬液的解离制备过程中丢失了位置信息。而加入了空间转录组后，可以解析具有复杂解剖组织的神经回路[6]，对各个脑区特定细分应用的方向得到了很大提升。
图1 单细胞转录组学在神经科学中的应用
2. 发育和可塑性
scRNA-seq同时可以揭示神经和胶质细胞类型在小鼠和人脑发育过程中变化的机制[7]。脑组织中干细胞和神经祖细胞在分化的过程中存在时间较短，且由于缺少已知的分子标志物很难被纯化分离。所以通过在多个时间点采样进行scRNA-seq和ST-seq，能够重构脑组织发育轨迹，揭示转录因子与下游效应因子动态调控特定神经元群体的过程[8]。此外，scRNA-seq也可以根据细胞中的体细胞突变，来构建分化轨迹，除了可以揭示发育动态过程研究，神经活动和可塑性而引起的基因表达变化也能进行深入研究[9]。
3. 细胞类型与疾病
单细胞测序在疾病中应用也十分广泛。有研究者通过对48个阿尔兹海默症患者的脑组织中的超过80000个细胞进行单细胞核测序和空间转录组测序，发现疾病的空间和细胞类型特异性变化，阿尔茨海默病 （AD） 的发病机制取决于环境和遗传因素，个体之间在分子水平上存在显著差异 [10]。除了应用在阿尔兹海默症中，其他疾病像抑郁、自闭症也已经得到应用[11]。脑肿瘤的研究加入空间转录组后，可以揭示肿瘤细胞与周围正常细胞、免疫细胞和基质细胞之间的相互作用[12]。研究者能够识别肿瘤特有的细胞群体及其在肿瘤微环境中的空间分布，进而理解肿瘤的发展、转移机制和治疗耐药性。空间转录组学能够在胚胎发育和器官发生过程中提供空间基因表达的动态信息，对于揭示畸形发生的早期机制具有重要意义[13]。空间转录组也能提供丰富的空间和功能信息，使得研究者能够更全面和深入地解析复杂疾病的生物学机制，如应用在脑相关疾病（如阿尔茨海默病、帕金森病等）中不同脑区域，可以将特定的基因表达模式与疾病的病理特征（如淀粉样斑块的形成、神经元丧失等）联系起来，从而识别出潜在的生物标志物和疾病机制，为靶向治疗和个性化医疗提供了新的思路。
03
单细胞及空间转录组文章案例解读
接下来从一篇研究文章切入，了解空间转录组在脑科学疾病的应用思路。
综合空间分析揭示胶质母细胞瘤具有多层组织结构[14]
题目：Integrative spatial analysis reveals a multi-layered organization of glioblastoma
发表期刊：Cell
发表时间：2024年4月
影响因子：45.5
研究意义：随着技术的发展，现在可以利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）等技术，对细胞类型和状态进行更细致、基因组范围的定量分析。这项研究的意义在于，它试图通过空间转录组学和蛋白质组学（如Visium和CODEX技术）来定量描述胶质瘤细胞的空间组织，这对于理解肿瘤微环境（TME）和癌症细胞状态具有重要意义（图2）。
图2 空间显示胶质母细胞瘤由无序区和结构化区组成
目前一些铁死亡诱导剂已经应用于肿瘤抑制和免疫治疗，铁死亡抑制剂也在多种疾病模型中表现出良好的治疗效果，靶向铁死亡发生的小分子虽有较多理论结果支撑，较差的药代动力学，靶向性，可能产生的副作用等都是阻碍这些小分子成药的绊脚石，因此，利用纳米技术构建这些小分子的传递系统可能是小分子成药的有力助推器。
04
研究结果
1. 空间转录组学揭示胶质瘤不同区域的基因表达特征
利用10X Visium空间转录组学平台，对胶质瘤进行空间分析，每个捕获点直径为55微米，包含1-35个细胞，揭示肿瘤内不同区域的基因表达特征。使用拷贝数异常（CNA）推断和Leiden聚类方法分类和注释捕获点。发现GBM的标志性特征（染色体增益和染色体缺失）和少突胶质细胞瘤的1p/19q共缺失（图3）。
图3 实验设计和每个样本的spot分类
2. 胶质瘤表达异质性的重复模式
通过定义14个基于基因身份重叠的表达程序簇，每个簇覆盖多个GBM样本的程序，为每组程序定义50个基因的共识程序（metaprogram, MP），反映GBM中反复出现的异质性模式，MP高度类似于单细胞状态，进一步模拟和验证这种方法能够突出个体状态的能力（图2D）。使用NMF方法捕捉主要表达特征，定义的MP跨多个样本一致检测到。发现三种间质MP（MES-like, MES-Hyp, MES-Ast）和反应性星形胶质细胞MP与高连接性相关。神经发育MP（OPC-like, NPC-like, AC-like）和细胞周期信号显著与侵袭性相关（图4）。
图4 通过计算推导注释空间模块
3. 利用CODEX技术验证空间转录组学的发现
利用CODEX技术在单细胞蛋白质水平上验证空间转录组学的发现，弥补Visium技术空间分辨率低的不足，使用标记抗体面板和CODEX技术分析12个样本的428,395个细胞， 识别主要的非恶性细胞类型和恶性细胞状态。研究发现CODEX和Visium数据在80%的样本中显著相关，可用于验证MP分配。CODEX技术更适合在单细胞水平识别T细胞和B细胞等稀有或分散细胞类型（图5）。
图5 CODEX对神经胶质瘤的空间分析
4. GBM肿瘤包含有序和无序区域
通过空间蛋白质组学方法，研究GBM肿瘤中不同区域的组织结构，确定有序和无序区域及其特征。通过两种联合分析，发现有序和无序区域在CODEX数据中一致性高，将CODEX数据从单个细胞转换为与Visium相当的伪点，发现伪点中的空间一致性差异不仅限于相邻点，还反映在单细胞及其邻近细胞中有序区域的。伪点同质性显著高于无序区域。发现结构化和无序区域在区域组成上的显著空间关联数量相似，但共定位和相邻性度量主要在结构化区域中识别出特定的相互作用。恶性状态主要分为两组：神经发育状态（OPC-like, NPC-like, AC-like）和间质与缺氧相关状态（MES-Hyp, MES-Ast, MES-like, Chromatin-Reg）。神经发育恶性状态与相应的非恶性状态之间有强烈的互动，三种间质状态与不同的免疫细胞子集有强烈互动，MES-Ast与T细胞最富集。MES-Hyp与免疫抑制相关，主要与炎性巨噬细胞相互作用。免疫细胞与血管有强烈互动，但与MES-Hyp解耦，表明血管灌注的有效长度尺度约为160微米（图片6）。
图6 跨尺度状态之间的空间关联
5. GBM空间组织的分层模型
研究将上述单个相互左右模块组合形成高阶组织，生成状态和共识相互作用的网络图。生成的网络图揭示一个五层组织结构，其中边（代表相互作用）仅存在于同层或相邻层之间。这一结构似乎主要由缺氧梯度主导：L1: 核心缺氧/坏死层，包含MES-Hyp；L2: 缺氧相关层，包含MES-Ast, MES-like, Inflammatory-Mac；L3: 血管生成反应/免疫枢纽层，包含Vasc, Mac, Prolif-Metab；L4: 恶性神经发育状态层，包含AC-like, OPC-like, NPC-like；L5: 脑实质层，包含Reactive-Ast, Oligo, Neuron。可以在细胞状态的详细分辨率上重新定义经典的组织学特征（图7）。
图7 GBM 空间组织的分层模型
05
文章亮点
1胶质瘤组织结构多层次：研究发现胶质瘤由无序和有序区域组成，其中有序区域展现出五层结构。这五层结构超越传统组织病理学可见的组织结构，与缺氧状态密切相关。
2 缺氧作为组织驱动因素：研究发现缺氧与广泛的细胞状态组织相关，包括缺氧/坏死区域以外的肿瘤区域。缺氧区域附近的肿瘤组织结构更紧密，而缺乏缺氧的肿瘤（如低级别 IDH 突变胶质瘤）则更无序。
3 新的细胞状态识别：研究通过空间转录组学数据识别之前未在单细胞或单核数据中定义的几个细胞状态，例如 MES-Ast 和 Chromatin-Reg。
4与传统组织病理学关联：研究提出的新五层组织模型与传统的组织病理学特征（如伪栅栏、微血管增殖、细胞肿瘤和前沿）具有高度一致性，并增加缺氧相关状态的层次。
5 潜在的治疗意义：缺氧和坏死区域的紧密组织结构可能对药物或免疫细胞更难以接近，从而对特定治疗更具抵抗力。研究结果为开发更有效治疗胶质瘤的药物和免疫疗法提供了新的见解。
SeekSpace®单细胞空间转录组致力于解决常规的空间转录组技术细胞类型判定不清，RNA扩散交叉污染导致表达不真实及数据分析复杂性的问题。因为是“单细胞分辨率”，所以能在达到清晰聚类和细胞注释精度的基础上，实现跨样本、跨组学的整合分析。上述的文章虽然亮点突出，但因为空转的分辨率不足，要结合其他组学进行确认，分区时需要大量的算法，对生信分析能力要求极高。加入SeekSpace®，这些问题就迎刃而解了。
优势1：细胞类型清晰可视化
脑组织中不同类型的细胞在神经网络中发挥着不同的功能。通过识别和区分这些细胞类型，研究人员可以更好地理解特定脑区的功能及其对行为和认知的影响。常规的空间转录组基因基于RNA透化的原理，分辨率较低，RNA随机扩散会造成基因检出率低和交叉污染，对于区分脑区复杂架构中的表达相似的细胞类型十分困难。SeekSpace®空间转录组技术对于脑区细胞区分清晰，可实现亚群聚类，帮助揭示脑肿瘤的演化过程和分子机制，无需再联合单细胞，蛋白互相验证细胞分群。
优势2：轻易解析复杂脑区细胞类型的空间定位
大脑中相关疾病发展机制均与特定类型的细胞功能失调密切相关。所以准确区分细胞类型有助于识别疾病的生物标志物以及潜在的治疗靶点。SeekSpace®空间转录组技术可清晰区分脑区每个基因单独表达的细胞，可以对异质性细胞及其周围正常细胞的基因表达模式进行研究。加上可以真实溯源到细胞空间位置，有助于确定不同脑区内的异质性较大细胞群体的特征，以及它们之间的相互作用，加入空间距离的阈值范围，使细胞通讯更加真实。
优势3：ROI自定义圈选，解析不同区域的差异化
许多相关神经退行性疾病与特定脑区的功能失调有关。通过解析脑区的不同区域，能够识别与特定疾病相关的区域变化，为病因的探讨、诊断和治疗提供有效的依据。例如，抑郁症、阿尔茨海默病等与海马体和前额叶皮层的功能异常密切相关。SeekSpace®空间转录组技术有配套的云平台，可以实现无代码可视化操作，实现ROI自定义圈选研究，可以直观解析疾病相关的脑区区域，可以识别出影响疾病发生发展的关键信号通路。
优势4：产品线丰富实现多组学联合
多组学分析能够从不同层面综合理解脑的复杂生物学。可以使研究更加全面地揭示脑功能及其调控机制，超越单一组学数据的局限。寻因生物作为自研单细胞平台，拥有多产线单细胞产品，可以通过多组学联合分析探究及验证脑相关疾病发生发展的演化机制。
图8 SeekSpace®产品优势
优势5：在当今快速发展的科学领域，脑科学作为研究人类认知与行为的关键学科，正迎来前所未有的机遇。加入SeekSpace®，有助于提升研究潜力，加速新发现的实现，能够在多种脑科学研究方向上深入探索。
表1 SeekSpace®产品对神经脑科学研究潜力的提升
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关于寻因生物
北京寻因生物科技有限公司（简称寻因生物）——专注单细胞测序技术自研、创新的国产技术平台。秉承“用技术温暖生命，预见未来”的企业愿景，致力成为您身边最值得信赖的单细胞创新合作伙伴。
寻因生物于2018年启动研发，历时6年，已完成覆盖单细胞仪器、实验、建库、分析全链条自研产品20余项，提供单细胞科研全周期服务&特殊样本解决方案50余种。
专注单细胞表达谱功能的单细胞3’转录组产品及助力免疫方向研究的单细胞免疫组产品，已实现与国际性能比肩。继而创新推出了真·单细胞分辨率的单细胞空间转录组；实现突变、可变剪切、lnc等更多信息更多物种信息检出的单细胞全序列转录组以及实现FFPE样本更长RNA覆盖的单细胞FFPE转录组等创新技术，从而覆盖肿瘤、免疫、感染、疾病发生发展和发育分化等研究方向。
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