我是小寻
背景：
肝细胞性肝癌（Hepatocellular carcinoma ，HCC）是最常见的原发性肝癌，生存率低且预后不良，是癌症死亡的第二大原因，因此了解肝癌转移的分子机制至关重要。选择性剪接（Alternative splicing ，AS）是扩展基因表达模式和产生蛋白质多样性的关键生物过程，异常事件一直被认为是癌症进展的关键标志之一。DEAD-box家族是一类以D(Asp)-E(Glu)-A(Ala)-D(Asp)为保守序列的RNA解旋酶家族，参与需要RNA调节的所有细胞过程，越来越多的研究表明，DDX家族在肿瘤组织中存在异常表达，且与肿瘤的发生、发展、转移以及侵袭等方面有关。其中DDX17已被报导参与许多重要肿瘤相关基因的AS事件，如NFAT5和CD44等，但其在肝癌中的作用还没有被很好的研究。
在这篇文章中作者报导了DDX17在肝癌中的经常性上调，且通过对于转移性肝癌和非转移性肝癌的RNA-seq分析，描绘了HCC的AS景观，确定了DDX17调节的PXN反义转录本1（lncRNA-PXN-AS1），参与促进HCC的肿瘤转移。
主要内容：
1. DDX17是选择性剪接的重要调节因子，被鉴定为与HCC转移密切相关的上调基因。
作者首先对于9对肝外转移的原发性HCC组织（EHMH）和9对无转移HCC组织（MFH）进行了RNA-seq分析，结果显示与相邻的非肿瘤组织（ANT）相比，在EHMH中共有5149个差异表达的蛋白质编码基因，而MFH中存在4087个差异表达的蛋白质编码基因，在此基础上，作者分析了数据中的AS事件，这些事件可分为五个主要的AS模式，包括替代的3'和5'剪接位点（A3SS和A5SS）、互斥外显子（MXE）、内含子保留（IR）和外显子跳跃（SE）（Fig.1A）。同时，作者评估了蛋白编码基因的显著剪接，发现相比MFH，EHMH中有1070个不同AS事件，且EHMH比MFH增加了AS事件（Fig.1B）。对于差异AS事件的富集分析显示，许多癌症相关的通路被富集，其中排名靠前的通路与肌动蛋白细胞骨架的调节和AMPK信号相关（Fig.1C）。此外，作者更详细地研究了人类癌症转移(HCMDB)数据库中1938个转移相关基因的剪接模式。发现相比于MFH，在EHMH有140个差异表达转移相关基因，且70个 (70/140, 50.00 %)基因有显著AS事件（Fig.1D-E）。转移相关基因的AS事件以A3SS(p = 0.027)、 A5SS(p= 0.041)、 IR(p = 0.029)和 SE(p = 0.001)增加最多；以上数据提示这些基因的剪接可能是肝癌转移的替代机制（Fig.1F）。剪接调节器（Splicing regulators）在AS过程中起着关键作用，为了确定与肝癌转移相关的剪接失调调节因子，作者汇总了452个不同来源的剪接调节因子，包括spliceaid2数据库，lamya ben ameur，nikolaigenov和anita sveen等，发现相比于MFH，在EHMH中28个剪接调节基因是失调的，其中27个基因上调，1个基因下调；且上调的基因中DDX17最为显著（Fig.1G）。28个差异因子与375个ASEs差异酶相关，参与多个生物学途径（Fig.1H-I）。
Fig.1
2. DDX17水平高与肝癌患者预后不良相关。
接下来，为探究DDX17在肝癌中的临床意义，作者首先证明了TCGA数据库中DDX17在肝癌中表达升高，且与患者的预后不良相关。进一步，作者通过RT-qPCR实验验证了肝癌组织中DDX17的mRNA水平明显高于正常组织（Fig.2C-D），且DDX17的水平与患者的生存率呈负相关（Fig.2E）。同时，为了探究DDX17在癌症转移中的作用，作者检测了28例转移肝细胞癌和56例无转移肝细胞癌中DDX17的mRNA和蛋白水平，结果显示与无转移的肝癌组织相比，转移性肝癌组织中DDX17的表达明显升高（Fig.2F-H）。以上数据证明DDX17的表达升高与肝癌的预后不良显著相关。
Fig.2
3. DDX17促进HCC生长和迁移。
为了确定DDX17的生物学功能，作者使用CRISPR-Cas9技术在肝癌细胞中进行了DDX17的敲除，Transwell实验结果显示DDX17的敲除明显抑制了HCC肿瘤细胞的迁移和侵袭（Fig.3A）。无脊椎动物膜是一种富含肌动蛋白的膜状突起，能够降解周围的细胞外间质以便入侵，因此，采用明胶降解法检测DDX17基因敲除对MHCC97H和HCCLM3细胞功能的影响，结果显示，DDX17基因敲除减弱了MHCC97H和HCCLM3细胞的侵袭能力（Fig.3B）。同时，F‐actin细胞染色证明了基因缺失后伪足形成明显减少（Fig.3C）。之后，作者进一步进行了体内实验，在肝细胞特异性DDX17敲除小鼠（DDX17HKO）和相应的对照小鼠（DDX17fl/fl）中构建DEN/CCl4诱导的肝癌发生模型，得到了与体外一致的实验结果，结果显示DDX17KO小鼠肝肿瘤的数目和大小以及肺转移灶减缓（Fig.3D-E），且DDX17过表达的小鼠中肝癌的体积和数量显著增加，肺转移明显增多（Fig.3F-G）。以上结果证明DDX17促进肝癌的发生发展。
Fig.3
4. DDX17诱导HCC细胞中lncRNA - PXN - AS1内含子3保留。
为了阐明DDX17促进肝癌转移的分子机制，作者经RNA-seq和RNA免疫沉淀和测序(RIP-seq)评估了DDX17敲除前后肝癌细胞中的AS事件，分析结果显示，作者发现了17个与DDX17密切相关的LncRNAs（Fig.4A-B），提示DDX17可能更倾向于影响lncRNA来驱动肝癌的转移。对于这些LncRNAs进行进一步分析，WB和RT-qPCR结果发现只有PXN-AS1-IR3转录本在DDX17 KO细胞中显著减少，而且DDX17过表达细胞中显著增加（Fig.4C-D,J）。同时，患者样本的RNA-seq数据显示EHMH和MFH组织中存在内含子3保留的PXN-AS1（Fig.4E）。除此之外，作者还构建了shDDX17细胞系，得到了一致的结论（Fig.4H-I），RIP和RNA pull down实验进一步验证了DDX17和PXN-AS1存在相互作用（Fig.4F-G）。
Fig.4
5. PXN- AS1- IR3在体外和体内促进HCC细胞的迁移和侵袭。
为了进一步证明PXN- AS1- IR3在肝癌中的作用，作者在细胞中过表达PXN-AS1-IR3，而不是PXN-AS1-WT，导致伤口愈合能力、细胞迁移和体外侵袭增加（Fig.5A-C）。荧光明胶降解实验显示，异位表达PXN-AS1-IR3的肝癌细胞细胞外基质降解活性增强（Fig.5D）。同时，作者构建了裸鼠原位肝癌转移模型，实验结果显示PXN-AS1-IR3的过表达，显著促进了裸鼠原位肝癌模型的肝癌发生和肺转移（Fig.5E-F）。总的来说，这些结果表明PXN-AS1-IR3参与DDX17介导的HCC迁移信号通路。
Fig.5
6. PXN-AS1-IR3通过MYC增强子的染色质修饰激活MYC信号通路。
为了确定PXN-AS1-IR3的下游靶点，作者对于PXN-AS1-IR3敲除前后的细胞进行了RNA-seq，GSEA分析显示发现PXN-AS1-IR3敲除显著下调了“MYC信号”和“Wnt通路”等（Fig.6A）,且MYC信号的GSEA在PXN-AS1-IR3敲除的HCC细胞中显示出显著富集（Fig.6B）。RT-qPCR结果显示PXN-AS1-IR3敲除后MYC下游靶点下调（Fig.6C）。RIP实验进一步验证了PXN-AS1-IR3和MYC之间存在相互作用（Fig.6D-E），之后，作者使用一系列PXN-AS1-IR3的截短片段进行RNA下拉分析，发现MYC特异性与内含子3区域发生相互作用（Fig.6F）。此外，PXN-AS1-IR3基因敲除导致MYC mRNA和蛋白水平降低（Fig.6G）。最后，作者在PXN-AS1-IR3敲除细胞或DDX17敲除细胞中过度表达MYC，以探讨DDX17对HCC细胞肿瘤发生的影响是否由MYC介导，结果显示MYC过度表达显著恢复了PXN-AS1-IR3敲除HCC细胞的迁移和侵袭能力（Fig.6H-I）。以上结果表明MYC参与DDX17-PXN-AS1-IR3调节轴。
Fig.6
7. PXN-AS1-IR3通过与Tex10相互作用，表观遗传调节MYC表达。
接下来，为了探索PXN-AS1-IR3如何调节MYC转录，作者进行了RNA pull down和质谱分析，以确定与PXN-AS1-IR3相关的蛋白质（Fig.7A）。Tex10通过修饰H3K4甲基化和招募辅激活因子组蛋白乙酰转移酶p300在转录调控中发挥重要作用，因此作者重点关注了这个蛋白，使用RNA pull down和RIP进行验证，结果证实了PXN-AS1-IR3与Tex10蛋白的显著结合（Fig.7B-C）。和预期的那样，Tex10的基因沉默能够抑制MYC蛋白水平（Fig.7D）。Tex10的过度表达显著阻断PXN-AS1-IR3敲除诱导的MYC蛋白抑制（Fig.7E）。CHIP实验分析进一步显示，PXN-AS1-IR3基因敲除显著降低了MYC基因增强子区Tex10和p300的占有率（Fig.7F），且增强子标记（H3K4me1和H3K27ac）水平明显降低（Fig.7G）。PXN-AS1-IR3基因敲除导致下游基因MMP2和MMP9启动子区域MYC结合富集度降低，最终导致MMP2和MMP9的mRNA和蛋白质水平降低（Fig.7H-I）。以上数据表明，PXN-AS1-IR3通过与Tex10相互作用，表观遗传调节MYC表达，从而促进肝癌的进展。
Fig.7
8. 人肝癌中DDX17、PXN-AS1-IR3和MYC表达存在相关性。
为了评估PXN-AS1在肝癌患者中的临床意义，作者检测了84对原发性肝癌和邻近非肿瘤肝组织（包括56对MFH和28对EHMH）中PXN-AS1-WT、PXN-AS1-IR3和MYC mRNA水平。与MFH相比，EHMH中的PXN-AS1-IR3和MYC mRNA水平显著上调，而PXN-AS1-WT未显示出显著变化（Fig.8A）。此外，作者在另一个HCC队列（40对EHMH和40对MFH）的血液样本和HCC样本中验证了PXN-AS1-IR3和PNX-AS1-WT水平，结果显示EHMH组血清和HCC组织中的PXN-AS1-IR3水平显著升高（Fig.8B-C）。相关性分析显示40对EHMH中DDX17与PXN-AS1-IR3、DDX17与MYC、PXN-AS1-IR3与MYC mRNA水平呈正相关（Fig.8D-F）。以上数据证明体内DDX17-PXN-AS1-IR3-MYC调节轴的存在（Fig.8G）。
Fig.8
总结讨论：
这篇文章是先通过RNA测序数据，从中去筛选关键的靶点,再针对该靶点去做功能验证，找到其调控的剪接变体，进而对剪接变体进行功能验证并分析其调控疾病的机制。这种思路比较适合课题之初,先通过高通量测序来找到关键因子,再去深入分析。
我是小寻
