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生物库重要提示：文末有惊喜
一、细胞培养的重要性
细胞培养是生命科学研究中的重要技术，为药物研发、疾病模型构建等提供基础。
细胞培养在现代生物科学中具有不可替代的重要性。它为研究细胞的结构和功能提供了理想的平台，使科学家能够在体外模拟体内环境，深入了解细胞的生长、分化、代谢、运动、分裂等生命过程。同时，细胞培养也是评估新药物安全性和有效性的重要方法，通过将新药物加入细胞培养物中，可以测试它们对细胞的影响，为药物研发提供关键数据。
在生产生物制品方面，细胞培养技术发挥着巨大作用。许多生物制品，如蛋白质和抗体等，可以通过细胞培养生产，为药物、疫苗和其他生物制品的生产提供了重要技术支持。此外，细胞培养还是研究癌症和其他疾病的基础，通过培养癌细胞等，可以了解疾病的特性和生长方式，为开发新的治疗方法提供思路。
细胞培养还可以用于培育细胞系，这些细胞系可用于研究和生产中。例如，人类肺细胞系可以用于研究肺癌和其他肺部疾病，大肠杆菌细胞系可以用于生产重组蛋白质。
在药物研发领域，细胞培养更是关键。它可以用于筛选和评估候选药物的活性、毒性和药代动力学，模拟人体组织和器官的反应，为药物研发提供高通量的方法，加快药物研发过程。同时，细胞培养在生物制药领域广泛用于大规模生产蛋白质药物和疫苗。
在生物技术领域，细胞培养为基因工程、蛋白质表达、基因组学和细胞治疗等提供了平台。通过大规模培养特定类型的细胞，可以利用其产生目标蛋白质或进行基因编辑，为生物技术的开发和应用奠定基础。
总之，细胞培养在生命科学研究、医学、药物研发和生物技术等领域都具有极其重要的地位，为探索生命奥秘、推动人类健康和生物技术的发展提供了坚实的基础。
二、细胞分离方法
（一）从血液、体液中分离细胞
采血方法：不同动物的采血方式有所不同。例如，小鼠可以采用尾尖采血、眼眶后静脉丛采血等方式；大鼠可以采用尾静脉采血、心脏采血等方式；兔子可以采用耳缘静脉采血、心脏采血等方式。
血液抗凝方法：
肝素法：肝素是一种常用的抗凝剂，可以阻止血液凝固。将肝素溶液加入血液中，混合均匀即可。
草酸盐法：草酸盐也可以作为抗凝剂使用。常用的草酸盐有草酸钾、草酸铵等。将草酸盐溶液加入血液中，混合均匀即可。
血样中红细胞和白细胞的分离：利用沉降速度不同原理分离。红细胞的比重较大，沉降速度较快；白细胞的比重较小，沉降速度较慢。可以将血液加入到含有一定浓度的高分子聚合物（如右旋糖酐）的溶液中，红细胞会快速下沉，而白细胞则留在溶液中。
血中单个核细胞的分离：采用速度沉降法。将血液加入到含有一定浓度的分层液（如聚蔗糖 - 泛影葡胺分层液）的离心管中，然后进行离心。单个核细胞会在分层液中形成一个特定的层面，可以用毛细吸管吸取这个层面的细胞，从而分离出单个核细胞。
血中单核细胞的分离：利用贴壁时间不同分离。单核细胞具有贴壁的特性，可以将血液中的细胞接种到培养瓶中，一段时间后，单核细胞会贴壁，而其他细胞则悬浮在培养液中。可以通过轻轻晃动培养瓶，将悬浮的细胞倒掉，然后用培养液将贴壁的单核细胞冲洗下来，从而分离出单核细胞。
黏附法分离血中单核细胞、T、B 淋巴细胞：将血液中的细胞接种到含有特定黏附分子的培养板上，单核细胞、T 淋巴细胞和 B 淋巴细胞会分别与不同的黏附分子结合。一段时间后，未结合的细胞可以用培养液冲洗掉，而结合的细胞则可以用特定的方法分离下来。
（二）从原代组织中分离细胞
胰蛋白酶分离法：
步骤：
去除不需要的组织后，将剩余组织切成 3 - 4mm 小片。
用无钙镁的平衡盐溶液清洗组织碎片，待组织碎片沉淀后去除上清液，重复清洗 2 - 3 次。
加入 0.25% 溶解在无钙镁的平衡盐溶液中的胰蛋白酶（100mg 组织加入 1ml 胰蛋白酶），在 4℃孵育 6 - 18 小时，使胰蛋白酶尽可能渗透进去。
移弃组织碎片中的胰蛋白酶，在 37℃孵育包含残留胰蛋白酶的组织碎片 20 - 30 分钟。
向组织碎片加入热的完全培养基，用移液管轻轻地分散组织。如果使用无血清培养基，要加入大豆胰蛋白酶抑制剂。
通过无菌不锈钢丝网过滤，分散所有剩余组织。计数和接种细胞，进行培养。
注意事项：
细胞暴露在胰蛋白酶中的时间要尽可能短，以保持最大的活性。
用无血清培养基时，要加入大豆胰蛋白酶抑制剂，以抑制胰蛋白酶活性。
胶原酶分离法：
操作流程：
用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成 3 - 4mm 小片，用 Hanks' 平衡液清洗组织碎片几次。
加入胶原酶（50 - 200 单位 /ml，溶解在 HBSS 中），在 37℃孵育 4 - 18 小时。加入 3mM CaCl₂增加解离效率。
通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。如果需要进一步的解聚，在碎片中加入新鲜的胶原酶。
通过离心在 HBSS 中清洗悬液几次。
再一次在培养基中悬浮细胞，计数和接种细胞，进行培养。
优势劣势：
优势：对胶原丰富的组织（如纤维性组织、上皮组织以及癌组织等）有较好的消化作用，能使细胞充分分散。
劣势：可能会对细胞产生一定的毒性，需要控制好胶原酶的浓度和作用时间。
Dispase 分离法：
分离过程：
用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成 3 - 4mm 小片，用不含钙镁的平衡盐溶液清洗组织碎片几次。
加入 Dispase（0.6 - 2.4 单位 /ml 溶解在无钙镁的平衡盐溶液）在 37℃孵育 20 分钟到几个小时。
通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。如果需要进一步的解聚，在碎片中加入新鲜的 Dispase。
通过离心在平衡盐溶液中清洗悬液几次。
再一次在培养基中悬浮细胞，计数和接种细胞，进行培养。
特点：对组织的损伤较小，能较好地保持细胞的活性。
（三）从原培养容器中分离细胞
一般步骤：
移弃使用过的细胞培养基。
使用不包含有钙镁的平衡盐溶液或 EDTA 清洗细胞。在培养瓶对着细胞的一面加入清洗溶液，通过转动培养瓶 1 到 2 分钟清洗细胞层，然后去除清洗液。
以 2～3ml/25cm² 的量，加选择的分离液到培养瓶对着细胞的一面。确保分离液覆盖细胞层。在 37℃孵育培养瓶，轻轻摇动培养瓶。通常，在 5 到 15 分钟内，细胞就会脱落。细胞分离需要的时间因细胞系不同而有所变化。仔细监测细胞分离过程，避免细胞受损伤。对难于从培养瓶基层分离的细胞系，可以轻轻敲打，以加速分离过程。
当细胞完全分离时，垂直放置培养瓶，让细胞流到培养瓶的底部。在培养瓶中加入完全培养基，通过移液管在单层细胞表面反复吹打来分散细胞。计数并再次培养细胞。
对于无血清培养基，加入大豆胰蛋白酶抑制剂。通常使用 1∶1（v∶v）0.25mg/ml 胰蛋白酶抑制剂到胰蛋白酶中将抑制胰蛋白酶活性。
不同细胞系的注意事项：每一种细胞系的最佳条件和施用浓度应该根据经验加以确定。再次培养时要检测细胞的活性，细胞的活率应该超过 90%。对于无血清培养基，要降低胰蛋白酶使用量。
（四）细胞挑取
准备工具：需要准备一个显微镜、一个移液器、一个培养皿、一个巴斯德吸管和一个离心管。
操作步骤：
从培养皿中取出细胞：用移液器吸取一定量的培养液，然后将其转移到离心管中。注意不要吸出过多的培养液，以免影响细胞的生长状态。
离心：将离心管放入离心机中，以适当的转速和时间进行离心。通常，离心速度和时间应该根据细胞的类型和密度进行调整。
弃上清液：离心结束后，小心地取出离心管，并将上清液弃去。注意不要将细胞沉淀也一起倒掉。
重悬细胞：用移液器吸取少量的培养液，小心地吹打细胞沉淀，使其重新悬浮在培养液中。
观察细胞：在显微镜下观察细胞，找到需要挑取的细胞。通常，可以使用相差显微镜或荧光显微镜来观察细胞。
挑取细胞：使用巴斯德吸管，将需要挑取的细胞从培养液中吸取出来，并放入另一个干净的离心管中。
重复步骤 3 - 7，直到获得足够数量的细胞。
培养细胞：将挑取的细胞放入新的培养皿中，加入适量的培养液，然后在适当的温度和湿度条件下进行培养。
三、细胞培养步骤
（一）复苏
从液氮中取出细胞冻存管，迅速投入 37℃水浴锅中，不断轻轻晃动，使冻存液在 1 分钟内快速融化。
将细胞悬液移入 15ml 离心管中，缓慢滴加预温的完全培养基，轻轻混匀，稀释冻存保护剂。然后以 200×g 左右的离心力离心 5 - 10 分钟，实际离心速度和时间因细胞类型而异。
弃去上清液，加入适量新鲜完全培养基，轻轻吹打悬浮细胞。
将细胞悬液接种到培养皿或培养瓶中，根据细胞种类和培养目的，选择合适的接种密度。一般建议在复苏初期保持较高的细胞密度，以提高细胞存活率。
用记号笔在培养皿或培养瓶上标记好细胞名称、复苏日期、传代次数等信息。将其放入 37℃、5% CO₂培养箱中培养。
次日，在显微镜下观察细胞贴壁情况，更换一次培养液，去除残留的冻存保护剂和死亡细胞，继续培养。之后按照常规培养方法定期换液，观察细胞生长状态。
（二）传代
当细胞在培养瓶中生长至覆盖率达到 80% - 90% 左右时，进行传代培养。不同细胞的生长速度和传代时机可能有所不同，需根据细胞特性和实验需求判断。
轻轻吸掉原有培养基，注意不要损伤细胞。
加入适量的消化液（如 0.25% 胰蛋白酶 - EDTA），以覆盖细胞为宜，轻轻晃动培养瓶，使消化液均匀分布。然后将培养瓶放入 37℃培养箱中消化 2 - 5 分钟，具体消化时间因细胞而异，需在显微镜下密切观察细胞形态变化。当发现细胞开始收缩、变圆，细胞间隙增大时，立即终止消化。
加入 2 倍胰蛋白酶量的含血清培养基，迅速轻柔地吹打细胞，使细胞从培养瓶壁上脱落下来，并形成均匀的细胞悬液，终止消化反应。血清可以抑制胰蛋白酶的活性，避免过度消化对细胞造成损伤。
将细胞悬液转移至离心管中，以 1000rpm/min 的转速离心 3 - 5 分钟，使细胞沉淀。
弃去上清液，根据细胞种类和实验需要，加入适量新鲜培养基重悬细胞。对于贴壁细胞，可按一定比例进行分瓶传代培养；悬浮细胞则可直接接种到新的培养瓶中，并补充新鲜培养基至所需体积。传代比例需根据细胞生长特性和实验目的确定，一般在 1:2 - 1:5 之间。
（三）冻存
当细胞处于对数生长期且生长状态良好时，进行冻存操作。先按传代培养的方法消化细胞，收集细胞悬液，以 1000rpm/min 的转速离心 3 - 5 分钟，弃去上清液。
用预冷的冻存液（一般含 10% DMSO 或甘油、10 - 20% 小牛血清的培养基）重悬细胞，调整细胞密度至 5×10⁶/ml - 1×10⁷/ml。
将细胞悬液分装到无菌冻存管中，每管 1 - 1.5ml。
在冻存管上标明细胞名称、冻存日期、批次等信息，然后进行冻存。标准的冻存程序为降温速率 - 1 - -2℃/min；当温度达 - 25℃以下时，可增至 - 5 - -10℃/min；到 - 100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管先放入 - 20℃冰箱 2 小时，然后放入 - 70℃冰箱中过夜，最后移入液氮容器内。如果有程序降温仪，可使用其按照设定程序进行更为精确的梯度降温冻存，以提高细胞冻存存活率。
四、提高细胞分离和培养成功率的方法
（一）有效监控支原体感染
细胞培养中支原体污染的影响。
细胞培养物被支原体污染后，会对细胞的生长繁殖和形态、代谢和功能以及染色体等方面产生不良影响。生长方面，细胞生长减慢，产生细胞病变，体积增大，碎片增多，在细胞质中产生颗粒，细胞内病毒繁殖受阻，形成空斑，贴壁细胞出现 “流沙样” 脱落、裂解等。代谢功能方面，支原体消耗精氨酸等营养物质，改变培养基成分，吸附在细胞表面破坏细胞膜完整性，影响细胞信号传递，消耗核苷库引起染色体异常等。
（二）选择低内毒素血清
血清内毒素对细胞培养的影响。
内毒素对不同细胞类型或细胞系的影响差别很大。内毒素是革兰氏阴性菌的细胞壁成分，通常在用于细胞培养的胎牛血清中发现。FBS 中内毒素的存在会对细胞生长和活力产生负面影响，并可能导致不准确的实验结果。内毒素可以激活免疫细胞，诱导促炎细胞因子的释放，从而导致细胞死亡，抑制细胞增殖。它们还可以干扰细胞过程，如 DNA 合成和蛋白质表达，从而影响实验结果。
根据内毒素含量对牛血清进行分级。
目前国际通用的分级方法，均以内毒素含量的高低来确定，内毒素含量越低，血清的级别就越高，以胎牛血清为例，当血清中内毒素含量≤10EU/ml 时，此血清为特级胎牛血清；当血清中内毒素含量﹥10EU/ml，≤25EU/ml 时，此血清为优级胎牛血清；当血清中内毒素含量≥25EU/ml 时，此血清为标准级胎牛血清。
（三）其他方法
无菌操作：保持无菌环境，避免污染。
无菌操作是决定细胞培养成败的关键因素。在实验进行前要制定好计划和操作程序，准备好器材物品并消毒。无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，实验用品以 70% ethanol 擦拭后带入无菌操作台内，细胞培养实验操作应在抬面之中央无菌区域。小心取用无菌实验物品，工作人员应注意自身安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。定期检测 CO2 钢瓶压力、CO2 浓度、温度、水盘污染情况、无菌操作台内气流压力等项目。
培养器具处理：清洁消毒培养器具。
在细胞培养前，实验室应保持清洁和整洁，工作台、试管架、培养箱等都需要经常清洁和消毒，以确保无菌环境。
培养基配制：准确称量混合，确保浓度和 pH 值正确。
在配制培养基时，应准确称量各种成分并充分混合，确保培养基的浓度正确。同时，要注意调节 pH 值，使其适合细胞生长。
细胞密度控制：根据细胞类型和实验要求确定合适密度。
不同类型的细胞和实验要求需要不同的细胞密度。在细胞培养过程中，应根据细胞类型和实验目的确定合适的细胞密度，以保证细胞的生长和实验结果的准确性。
培养条件优化：了解不同细胞的培养条件要求。
不同的细胞有不同的培养条件要求，包括温度、CO2 浓度、湿度等。在细胞培养过程中，应了解不同细胞的培养条件要求，并进行优化，以提高细胞培养的成功率。
细胞检测和鉴定：定期鉴定检测细胞纯度。
定期对细胞进行检测和鉴定，以确保细胞的纯度。可以通过形态学观察、免疫染色、分子生物学方法等进行细胞鉴定。
冻存备份：防止细胞丢失或污染。
当细胞处于对数生长期且生长状态良好时，进行冻存操作。冻存可以防止细胞丢失或污染，同时也方便后续实验的使用。
观察和记录：密切观察细胞生长状态并记录。
在细胞培养过程中，应密切观察细胞的生长状态，包括细胞形态、生长速度、密度等，并进行记录。这有助于及时发现问题并采取相应的措施。
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