【生物工艺】生物制药灌流工艺：创新与前景
教育
科学
2024-11-17 08:03
山东
一、灌流工艺概述
灌流工艺在生物制药领域发挥着重要作用。在生物发酵过程中，不断向发酵罐灌流培养液，包括培养基、添加物、碱等，同时以相同流量流出废弃的培养液，如耗竭的培养基、细胞废弃、采样体积等。通过这种方式，为细胞提供一个比较恒定的培养环境，从而获得较高的单位体积产率。研究表明，在 CHO 细胞生产重组人干扰素 β（β-IFN）时，低温灌流培养与批次培养相比，产率可提高 3.5 倍，单位体积产率提升 7 倍，并且可降低 39% 的聚集体和提高一定的生物活性。在生物反应器中进行短时间灌流，紧接着使用高浓缩补料进行常规补料分批培养，与传统补料分批工艺相比，整体产率增加近一倍。灌流反应器和四柱式周期性逆流色谱的整合系统用于连续捕获目的蛋白，比当前灌流或补料分批培养的单位体积产率高得多。稳定的灌流工艺需要适当控制培养基的补进和流出速度，保持所需的灌流速率。通过活细胞浓度的实时监测、稳定理想的细胞特异性灌流速率（cell specific perfusion rate, CSPR）以及灌流速率等参数来调节细胞排出量，反应器内可维持恒定的工作体积和细胞密度。每日工作体积与灌注培养基的体积之比被称为培养基置换率（VVD），高置换率是提升产物及产出率的关键。而产品取样、细胞废弃等指标也会影响到 VVD 数值。细胞废弃率（CDR）通常是以 VVD 培养基流速中以废弃去除而不以耗竭培养基去除的百分比。减少细胞废弃率，可以有效地提高工艺生产效率。在灌流培养技术工艺中，活细胞密度（VCD）指标也同样影响到到培养基置换率（VVD）。总之，灌流工艺通过不断更新培养液，为细胞提供稳定的生长环境，提高单位体积产率，在生物制药领域具有广阔的应用前景。二、灌流工艺的应用案例
（一）中空纤维的应用
中空纤维以其开放式的流路设计，在灌流工艺中具有高容污能力和剪切力温和等特点。在细胞截留和培养基置换环节，常用的细胞截留装置有 ATF 和 TFF，科学家对这两种装置进行探索，如在一篇技术文献中，CHO-DHFR 细胞接种于某 10L 波浪式生物反应器中，一些实验通过反应器与 ATF-2 连接，另一些实验则通过蠕动泵和中空纤维柱（PS 材质，850cm²）实现细胞截留。当反应器内细胞密度达到 2 - 3MCell/mL 时开始进行灌流，灌流速率控制为 1 - 10RV/day，培养时间为 27 天，结果显示两种细胞截留装置均可以实现稳定的灌流工艺，细胞密度可达 200MCell/mL。此外，中空纤维还可应用于菌体收集、细胞及菌体收获液的澄清、病毒及核酸类产品的浓缩和透析、脂质体的浓缩和透析等工艺环节。（二）药明生物的实践
药明生物作为全球生物药研发的赋能者，拥有的灌流车间不断学习新技术拓展自身产能。药明生物在原液生产领域拥有成熟的商业化一厂、二厂、四厂、五厂，其中二厂灌流车间更是完成了多个项目的复杂工艺生产和验证，如今将连续捕获工艺和 CFB 工艺的相关生产项目都成功地推进到商业化生产阶段。药明生物自主开发出间歇性灌流分批补料细胞培养（Intermittent-Perfusion Fed-Batch, IPFB）工艺，在 IFB 的生产过程中穿插间歇性灌流操作，显著提高产量，相较于 IFB，IPFB 模式可以将产量平均提升 50%。进一步开发的超强化 IPFB（Ultra-Intensified IPFB），即 WuXiUI 生物工艺平台，可将产量显著提升 3 - 6 倍之多，结合平台培养基 MagniCHO，在 20 余种不同分子的细胞系上测试，获得可与国际领先商业化培养基效果相媲美或更好的产量提升。同时，药明生物开发出 WuXiUI 纯化平台策略，提升下游处理能力，将纯化处理能力提升一倍之多，降低下游生产时长 50% 以上，节约 30% - 70% 的下游物料消耗，降低整体原液生产成本，相比与同规模的 TFB 工艺，WuXiUI 生产成本（COGs）可显著降低 60 - 80%。（三）CytoLinX® WB 培养袋的应用
CytoLinX® WB 一次性细胞培养袋对于连续灌流等多种培养方式具有很好的兼容性。配套的无菌培养袋内预先无菌集成了细胞截留过滤器，有效截留细胞的同时，避免了外接细胞截留装置易堵塞、无菌连接容易污染等问题，操作简单可靠，有效提高培养细胞的密度和产量。广泛用于科研、研发、生产中的种子培养，及新型疗法如细胞治疗等领域。针对不同应用场景，提供多种膜材可选。灌流培养袋共有两种截留膜，针对不同细胞直径，分为 1.2um 和 5um 两种孔径。5um 截留膜生物相容性好，强度高，可用于 CHO 细胞、杂交瘤细胞、昆虫细胞等细胞培养，一般可获得 1 - 5 x107cell/ml 以上的细胞密度。1.2um 截留膜具有良好的柔韧性，适用于 HEK293 细胞、NK 细胞和 T 细胞等，膜材质地轻薄但柔韧性好，培养过程中对细胞的剪切力更低。例如，CytoLinX® WB 一次性细胞培养袋用于灌流培养 CHO 细胞，细胞培养生长趋势与历史批次趋势基本一致，结果符合预期，密度超过 4×107 cells/ml；用于灌流培养 T 细胞，细胞培养生长趋势与历史批次趋势基本一致，结果符合预期，密度超过 1×107 cells/ml。三、灌流工艺的优势
（一）提高产量和质量
灌流培养工艺可以显著提高重组蛋白和单克隆抗体的产量、质量，成本也更低。与微生物及昆虫细胞相比，哺乳动物细胞具有翻译后修饰功能，在蛋白类药物表达方面具有独特优势，是生物药生产的首选平台。然而，哺乳动物细胞倍增时间长、代谢途径复杂、对外界环境敏感性强，对营养要求苛刻，细胞状态容易改变，较之传统的微生物细胞培养，难度更大。灌流培养工艺能够为细胞提供稳定且有利的生长环境，在细胞培养的过程中，清除和目标产物一起产生的废物，保持培养基的健康，同时还可以通过蠕动泵，对使用过的培养基进行更换。例如，在 CHO 细胞生产重组人干扰素 -β(β-IFN) 时，低温灌流培养与批次培养相比，产率可提高 3.5 倍，单位体积产率提升 7 倍，并且可降低 39% 的聚集体和提高一定的生物活性。药明生物的超强化 IPFB（Ultra-Intensified IPFB），即 WuXiUI 生物工艺平台，可将产量显著提升 3 - 6 倍之多。这些数据充分证明了灌流工艺在提高产量和质量方面的显著优势。（二）精准温控的重要性
温度在灌流培养工艺中起着关键作用。灌流式生物反应器使用专门针对培养条件，优化过后的细胞系，一旦达到最佳细胞密度和条件，就会启动目标蛋白质或抗体的表达。温度、pH 值和化学条件，对于触发和维持目标蛋白质或单克隆抗体的表达至关重要。由于优化的细胞系是为理想条件设计的，所以一旦工艺条件偏离预先设定的参数，运行就会结束。LAUDA 以精确的温度控制技术著称，是许多主要生物反应器制造商的首选。LAUDA 的温度控制设备有极高的温度稳定性，以及工艺所需的高功率，并且符合 GMP 要求，操作简便。对于不同规模的细胞培养 —— 从 50L 到 5000L，LAUDA 都有相应的温度控制解决方案，可为整个细胞培养过程，保持所需的最佳条件。（三）与传统工艺对比
与补料分批工艺相比，灌流工艺在细胞密度、单位体积产率、培养时间等方面具有明显优势。灌流反应器可以长时间连续运行，有些系统可以运行长达六个月。在这一过程中，培养产物通过中空纤维滤芯过滤，产生粗抗体混合物，然后再通过色谱法对产物进行纯化。灌流细胞培养的过程输出已被证明明显高于传统的补料分批工艺，因为细胞密度显著更高，生物反应器停机时间减少。此外，灌流工艺需要的设备占地面积比补料分批工艺小得多。然而，灌流工艺也存在操作挑战和缺点，从技术及无菌性角度来讲，其操作的挑战性更大。大量的收获液连续累积，加大了下游处理量。此外，培养基的用量也更大。但随着技术的不断进步，这些问题正在逐步得到解决，灌流工艺在生物制药领域的应用前景越来越广阔。四、灌流工艺的发展前景
（一）个性化治疗趋势
随着医学技术的不断进步，灌流工艺在未来将更加注重个性化治疗方案的制定。通过基因检测、蛋白质组学等技术，医生可以深入了解患者的遗传信息和生理特征，为每位患者量身定制最佳的灌流治疗方案。例如，针对不同患者的细胞特性和代谢需求，调整灌流培养基的成分和流速，以实现更精准的治疗效果。个体化的血液灌流器也将成为未来发展的重要方向。通过 3D 打印等先进技术，可以生产出适应不同患者解剖结构和生理特征的灌流器。这种个性化的灌流器能够提高患者的舒适度和治疗效果，减少并发症的发生。同时，个性化灌流器的研发也将促进生物制药领域与材料科学、工程学等多学科的融合，推动技术的不断创新。（二）精准医疗融合
精准医疗的理念将深刻影响灌流工艺的发展，推动其走向精准化。先进的诊断技术，如分子诊断、影像诊断等，可以更准确地判断患者的病情和细胞状态，为灌流治疗提供精准的指导。例如，通过分子诊断技术检测患者细胞中的特定生物标志物，确定最佳的灌流时机和治疗参数。精准医疗技术还可以实时监测灌流治疗的效果。利用传感器和监测设备，实时获取患者的生理参数和治疗过程中的数据，根据疗效及时调整治疗方案，提高治疗的针对性和效果。例如，通过监测细胞密度、代谢产物浓度等指标，调整灌流速率和培养基成分，确保治疗始终处于最佳状态。（三）智能化技术应用
智能化技术在灌流工艺中的应用将极大地提高治疗的自动化和智能化程度。智能化操作系统将成为未来灌流设备的重要组成部分。这些系统可以根据患者的生理参数和治疗效果，实时调整灌流的参数，如流速、温度、压力等，实现精准的治疗控制。例如，当监测到患者的体温升高时，系统自动调整灌流温度，以维持患者的生理平衡。大数据与机器学习辅助决策也将为灌流工艺带来新的突破。通过对大量灌流治疗过程中的数据进行挖掘和分析，为医生提供辅助决策支持，提高治疗效果和患者的生存率。例如，利用机器学习算法预测患者对不同灌流方案的反应，为医生制定个性化治疗方案提供参考。（四）市场前景广阔
灌流工艺在临床医疗、急救等领域具有广阔的应用前景。随着生物制药技术的不断发展和人们对健康需求的提高，灌流工艺将在治疗各种疾病中发挥越来越重要的作用。例如，在癌症治疗中，灌流工艺可以用于清除肿瘤释放的毒素和代谢产物，辅助化疗和放疗，提高治疗效果。在急救领域，灌流工艺可以快速清除体内的毒物和有害物质，为患者争取宝贵的治疗时间。未来，灌流工艺将形成完善的产业链，涉及器材制造、技术研发、医疗服务等多个环节。这将为市场提供更多商机，促进产业的快速发展。同时，随着全球化的加速，灌流工艺的国际市场将不断扩大，为全球的医疗健康产业提供更多增长动力。例如，中国的生物制药企业可以将先进的灌流技术推向国际市场，与国际企业合作，共同推动全球灌流工艺的发展。赶紧扫码入群，解锁更多惊喜
↓↓↓
![]()
▲ 点击上方卡片关注生物库，带你畅游生命科学的海洋
