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生物库重要提示：文末有惊喜
一、细胞培养环境的重要性
细胞培养环境对细胞的生长、增殖和功能发挥起着至关重要的作用，合适的环境是细胞表现特定功能的基础。
细胞培养的环境因素众多，任何一个环节出现问题都可能影响细胞的状态甚至导致实验失败。首先，细胞生长的附着物或支持物性质会极大地影响细胞的生长状态。例如，固体支持物如塑料板可以为贴壁细胞提供生长的基础，半固体的凝胶如胶原凝胶则可能模拟细胞在体内的微环境，适合特定类型细胞的生长。液体支持物如悬浮细胞的培养液则为悬浮细胞提供生存空间。不同性质的附着物或支持物会影响细胞的形态、增殖速度和功能表达。
与其他细胞的接触程度也对细胞培养有重要影响。在体内，细胞之间存在复杂的相互作用，这种相互作用对于细胞的正常生理功能至关重要。在体外培养中，适当的细胞接触可以促进细胞间的信号传递，影响细胞的生长和分化。
培养基的理化性质和成分更是关键因素之一。培养基包含细胞生长所需的各种营养物质，如碳水化合物、氨基酸、无机盐、维生素等。不同的细胞对培养基的需求不同，选择合适的培养基是细胞培养成功的重要保障。此外，培养基的 pH 值、渗透压等理化性质也需要严格控制。大多数细胞适宜的 pH 范围往往是 7.2～7.4，偏离这个范围可能对细胞培养产生有害影响。而渗透压也是体外培养细胞的重要条件之一，多数体外培养的细胞对渗透压都有一定的耐受能力，实际应用中，260～320mmol/L 的渗透压可适用于大多数细胞。
气相成分主要包括氧气和二氧化碳。氧气参与细胞的三羧酸循环，为细胞生存、代谢与合成提供能量。二氧化碳既是细胞的代谢产物，又是细胞生长的必需成分，还与维持培养液的 pH 有关。在开放式培养中，一般把细胞置于 95% 空气加 5% 二氧化碳混合气体环境中。
培养温度同样至关重要。一般哺乳类与禽类细胞在体外培养的适宜温度是 37～38℃。温度过高或过低都会影响细胞的生长。细胞对低温的耐受能力要强于对高温的耐受能力，在低温下，细胞的代谢活力及核分裂能力降低；若温度过高，甚至可导致细胞死亡。
二、影响细胞培养的主要因素
（一）细胞生长附着物或支持物性质
贴壁细胞在正常情况下需要附着物才能良好生长。常用的基质如多聚赖氨酸，分为 D 型和 L 型，能够促进细胞黏附。明胶也是一种常用的附着物，其具有良好的生物相容性，能为细胞提供适宜的生长表面。胶原蛋白作为细胞外基质的重要成分，对于一些对生长环境要求较高的细胞，如干细胞等，具有很好的支持作用。细胞外基质混合物则可以模拟体内细胞生长的微环境，为细胞提供更复杂的生长信号。在培养一些特殊细胞时，根据细胞的特性选择合适的附着物或支持物进行包被后使用，能够显著提高细胞的黏附性和生长状态。
（二）与其他细胞的接触程度
正常细胞（二倍体）存在贴壁接触抑制现象。当细胞长满后，生长会停止。这是因为细胞之间的接触会触发一系列信号传导，抑制细胞的进一步增殖。而肿瘤细胞等非正常细胞的接触抑制作用较弱，可生长至较高的细胞密度。但需要注意的是，某些细胞一旦生长过度，其损伤难以逆转。例如，当细胞密度过高时，可能会导致营养物质供应不足、代谢废物积累等问题，从而影响细胞的生存和功能。因此，在培养细胞时，不建议细胞密度太高，一般细胞汇合度达到 70 - 80% 即可传代，避免细胞过度生长带来的不良影响。
（三）培养基的理化性质和成分
水是细胞培养的主要成分，哺乳动物细胞对水中的杂质高度敏感，包括内毒素、细菌、微量元素、微量有机物等。为了确保细胞培养的成功，必须使用高纯水，一般符合注射用水标准或超纯水标准，其纯度通常用电导率或电阻（>18MΩcm）衡量或低有机碳含量（≤15ppb），且必须不含有内毒素。
葡萄糖作为细胞主要碳源和能量来源，在不同细胞培养基中的含量有所差异，一般为 5 - 25mmol/L。例如，一些培养基中葡萄糖终浓度为 5.5mM，大约等于人体血液中的葡萄糖水平。但可以根据具体需求购买葡萄糖浓度变化范围很广的培养基，甚至可以购买不含葡萄糖的培养基，然后自行定制浓度，用于模拟特殊状况或进行特定研究。
氨基酸是细胞的氮源，其中谷氨酰胺对细胞生长至关重要。在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良甚至死亡。由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，应置于 -20℃冰箱中保存，在使用前加入培养液内。体外培养时，细胞对谷氨酰胺的需求较大。非必需氨基酸在细胞密度较低时对细胞生长影响较小，但在高密度细胞培养时，可能成为限速因素。不同的细胞以不同的速率利用氨基酸，且培养基中氨基酸浓度的小改变都会影响细胞的密度和生长以及抗体糖基化。
维生素是维持细胞生长的生物活性物质，不同配方的细胞培养基中维生素浓度有差异。维生素在细胞培养中虽然需求量相对较少，但对细胞的正常代谢和生长起着重要的调节作用。
无机盐维持细胞培养液渗透压平衡，参与细胞代谢活动。微量元素对细胞生长代谢和产物合成有促进作用。培养液的渗透压是一个非常重要的因素，多数体外培养的细胞对渗透压有一定的耐受能力，260 - 320mmol/L 的渗透压可适用于大多数细胞。
在低血清、无血清细胞培养基中，常添加蛋白质、多肽等成分满足细胞生长增殖需要。这些成分可以替代血清中的一些生物活性物质，为细胞提供必要的生长信号和营养支持。
（四）气相成分
大部分培养基适合于 95% 空气加 5% CO₂的混合气体环境。但部分培养基如 L15 培养基适合于 100% 空气，CO₂会导致 L15 培养液 pH 降低（培养液变黄），严重影响细胞生长。若需要用 L15 培养基培养细胞，但没有 100% 空气培养箱时，可以拧紧瓶盖或换培养基（效果可能更好）培养。适用于 CO₂环境的培养基需保持培养瓶透气，以确保气体交换顺畅。培养细胞时需注意参照说明书选择培养基及培养环境，避免因气相成分不匹配而影响细胞生长。
（五）培养温度
对于大部分人源细胞和温血动物细胞系，适宜温度是 37℃，这个温度接近人体体温，有利于细胞的正常代谢和生长。但为了安全可以再稍低一些，高于体温的温度要比低于体温的温度更易产生问题。对于鸟类细胞，由于其体温较高，所以培养温度可以设置为 38.5℃左右。在细胞培养过程中，保持温度稳定非常重要。不要长时间敞开培养箱的门，并且不要将培养器皿大量重叠堆放在培养箱中，避免空气不循环导致温度不均匀。温度的波动可能会影响细胞的生长状态，甚至导致细胞死亡。
三、其他影响因素及注意事项
除了上述五个主要方面，还有一些其他因素也会对细胞培养产生影响。
首先是无菌操作。在细胞培养过程中，严格的无菌操作是至关重要的。微生物的污染可使细胞迅速死亡，因此所有操作必须在无菌条件下进行，使用无菌的培养皿、移液器和试剂等。例如，据统计，因污染导致的细胞培养失败案例约占总失败案例的 30%。
其次是细胞接种量。细胞接种量会影响细胞的生长速度和密度。不同的细胞类型对接种量的要求不同，一般来说，接种量过少可能导致细胞生长缓慢，而接种量过多则可能引起细胞过度拥挤，影响细胞的生长和功能。
再者是培养液的好坏。培养液是细胞生长的重要因素，除了包含各种营养物质外，其质量也会影响细胞的生长。例如，血清作为培养液的重要成分，其来源不可靠可能会造成细胞污染，而且批次之间可能会有很大差异。因此，一些实验会采用减血清或无血清培养基，以提高细胞培养的一致性。
在细胞培养过程中，还需要注意规范操作。例如，传代细胞时，瓶口每次打开或者关闭都需要在酒精灯上消毒；所有的操作尽量靠近酒精灯火焰，每次最好只进行一种细胞的操作，每种细胞使用一套器材，避免交叉感染。
此外，每天观察细胞状态也是非常重要的。定期观察细胞的形态、生长情况和代谢活动，及时发现并解决问题。如发现细胞形态异常、生长缓慢或死亡等情况，应及时分析原因并采取相应的措施。
总之，细胞培养是一个复杂的过程，需要综合考虑各种因素，严格遵守操作规程，才能确保细胞培养的成功。
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