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生物库重要提示：文末有惊喜
一、组织培养概述
组织培养是一种在体外模拟体内环境进行培养的方法，它从生物体取出组织或细胞，通过人工控制条件，使其在无菌、适宜温度、酸碱度和一定营养条件下生存、生长、繁殖并维持主要结构和功能。
组织培养技术在多个领域有着广泛的应用。在植物领域，植物组织培养可以从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞等，通过无菌操作在人工控制条件下进行培养，以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品。例如，1958 年美国的 Steward 和德国的 Reinert 分别由培养的胡萝卜细胞诱导形成了胚状体，1965 年由 Vasil 和 Hildebrandt 用单个分离的细胞培养获得整个植株的再生，从而使植物细胞全能性的理论真正得到了科学的证实。
在细胞培养方面，细胞培养是指在体外模拟体内环境（无菌、适宜温度、酸碱度和一定营养条件等），使之生存、生长、繁殖并维持主要结构和功能的一种方法。细胞培养技术可以由一个细胞经过大量培养成为简单的单细胞或极少分化的多细胞，这是克隆技术必不可少的环节。细胞培养技术在生物学研究中具有重要作用，通过细胞培养既可以获得大量细胞，又可以借此研究细胞的信号转导、细胞的合成代谢、细胞的生长增殖等。
总之，组织培养技术为生物学研究和实际应用提供了重要的手段和方法。
二、器官培养
（一）定义与特点
器官培养是将活体的一部分进行分离培养，旨在保持组织的三维结构，同时模仿器官在各种状态下的功能。在培养过程中，要防止被培养的器官或组织片在培养基上变为片状扩张，尽量维持其原有的立体状态，从而促进其增殖与分化。
（二）培养方法
动物器官培养的方法丰富多样。早在 1929 年，Fell 等就开始用血浆和胚胎抽出液进行动物器官培养，1952 年，E．Wolff 等在含有胚抽出液的琼脂培养基上直接放置器官进行培养。此外，还有用含有血清和合成培养液等方法，以及将器官放在玻璃纸上的培养方法等。到 21 世纪，这些方法不断改良，出现了完全合成培养法等先进技术。在植物器官培养方面，可以对茎顶、胚轴、叶胚、子房、花、果实等进行培养。植物器官培养的培养基和培养方法与组织培养总体差别不大，但对于含有叶绿素的器官，需要在光下进行单独营养，此时仅在简单的只含无机盐的培养基中即可发育。然而，在暗培养条件下，如果不供给呼吸基质、维生素类以及其它有机物，则不能生长。
（三）肿瘤类器官培养示例
胃癌类器官培养：除了使用 ADMEM/F12 培养基和基底膜基质外，还添加了 EGF、Noggin、R-Spondin 1、FGF-10 等细胞因子。具体培养步骤包括配置 PDO 培养基、样本收集、样本处理、接种细胞、固化基质以及定期更换培养基等。
结直肠癌类器官培养：患者来源的肿瘤类器官已成为结直肠癌临床前研究的出色模型。其培养体系中，肠上皮细胞的自我更新由位于隐窝中的 Lgr5 干细胞驱动，Wnt 信号、EGF 信号、Noggin 等对维持隐窝干细胞活跃至关重要。
肝癌类器官培养：原发性肝细胞癌主要分为肝细胞癌、胆管细胞癌和混合型。在肝细胞癌类器官培养中需要使用地塞米松，而胆管细胞性肝细胞癌类器官培养则需加入 R-spondin 1 来维持细胞生长。
乳腺癌类器官培养：乳腺癌类器官的培养基与其他肿瘤略有不同，在培养基中添加 Neuregulin 1 可维持类器官有效再生和长期增殖。
三、原代外植块培养
（一）定义与方法
原代外植块培养作为组织培养的重要方法之一，在生物医学研究中发挥着关键作用。从人或动物体内取出的小块组织，就如同一个微小的生命宝库，蕴含着各种细胞类型和生物活性物质。在严格的无菌条件下，确保培养环境不受外界污染，为组织的生存和生长提供了纯净的空间。适宜的温度如同大自然的怀抱，给予组织适宜的生长环境，一般来说，人体细胞培养的温度通常在 37℃左右，这个温度能够促进细胞的代谢活动和生长繁殖。
同时，营养条件也是至关重要的。加入少量含高浓度血清（通常为 40 %~50 %）的培养基，为组织提供了丰富的营养物质，如氨基酸、维生素、无机物等，这些物质是细胞生长必须的物质。血清中还含有各种生长因子，如胰岛素、肾上腺皮质激素、类固醇激素等，能够促进细胞的生长和增殖。表面张力使标本保持原位，这一神奇的自然力量确保了组织在培养瓶或皮氏培养皿的表面能够稳定地附着，为细胞的生长提供了坚实的基础。随着时间的推移，组织中的细胞开始自发地贴附于表面，并逐渐开始生长，开启了一段在体外的生命之旅。
（二）与其他培养类型的关联
原代外植块培养与器官培养和细胞培养共同构成了组织培养的主要类型，它们之间相互关联、相互补充。器官培养注重保持组织的三维结构和功能，而原代外植块培养则是从更小的组织块层面进行培养，为进一步的细胞培养提供了基础。在某些情况下，原代外植块培养可以作为器官培养的前期步骤，通过对小块组织的培养，观察其生长和分化情况，为器官培养提供参考。
与细胞培养相比，原代外植块培养更接近体内的生理环境。细胞培养是将原代外植块生长晕用机械法或酶法分离细胞，作成细胞悬液，再培养于固体基质上，成单层细胞生长或在培养液中呈悬浮状态培养。原代外植块培养保留了组织的一定结构和细胞间的相互作用，更能反映体内细胞的生存状态和功能。
例如，在研究某些疾病的发病机制时，可以先通过原代外植块培养观察组织的整体变化，然后进一步进行细胞培养，深入研究特定细胞类型的功能和行为。这种综合运用不同培养类型的方法，为生物医学研究提供了更全面、更深入的视角，有助于揭示生命的奥秘和疾病的本质。
四、细胞培养
（一）定义与目的
细胞培养是指在体外模拟体内环境（无菌、适宜温度、酸碱度和一定营养条件等），对单个细胞或单一细胞群进行培养，使其在适宜条件下生长并保持细胞特性。其目的在于通过对细胞的培养，深入研究细胞的生物学特性，如细胞的信号转导、合成代谢、生长增殖等，为生物学研究和医学应用提供重要的实验手段和理论依据。
（二）培养方法
细胞复苏：将冻存细胞从液氮中取出后，在 37℃水浴锅内不断摇动促进其融化。移入离心管中，加入预热的 DMEM 完全培养基（其中胎牛血清约为 10%），轻轻吹匀，离心，500g 离心 2min，弃上清液。加入 DMEM 完全培养基清洗，弃上清液。加入 DMEM 完全培养基，轻轻吹打混匀，制成细胞悬液，接种于培养皿 / 瓶中，在含 5% CO₂的细胞培养箱中培养。
细胞传代：当细胞密度达到 80% - 90% 时，去掉完全培养基，用 1X PBS 清洗 2 次。加入胰蛋白酶进行消化，放入细胞培养箱中约 2 - 3min。加入适量 DMEM 完全培养基终止胰蛋白酶消化，转移至离心管后 500g 离心 2min，弃上清液，再加入 DMEM 完全培养基清洗，弃上清液。加入 DMEM 完全培养基，轻轻吹打混匀，吸取 10 微升进行计数，然后按照所需细胞量在含 5% CO₂的细胞培养箱继续培养。
细胞冻存：当细胞密度达到 80% - 90% 时，去掉完全培养基，用 1X PBS 清洗 2 次。加入胰蛋白酶进行消化，放入细胞培养箱中约 2 - 3min。加入 DMEM 完全培养基终止胰蛋白酶消化，转移至离心管后 500g 离心 2min，弃上清液，再加入 DMEM 完全培养基清洗，弃上清液。加入 lml 冻存液（90% 胎牛血清，10% DMSO），放入冻存管内（管内有异丙醇），立即放入 4oC 冰箱中冻存 30min，然后放入 -20oC 冰箱中冻存 30min，再置于 -80℃冰箱内过夜。第二天放入液氮中，可以保存至少两年，如不放人液氮，可以保存三个月。
在细胞培养过程中，需注意以下环节：
培养环境：细胞需要在适宜的温度、湿度、氧气和二氧化碳浓度等环境中生长。一般哺乳类与禽类细胞在体外培养的适宜温度是 37 - 38℃，在开放式培养中，以 5% 的二氧化碳气体比例为宜。
培养基：选择适合细胞类型的培养基，并保持其适当的 pH 值和营养成分。针对不同细胞的营养需求，有多种合成培养基可供选择，如 EBSS、Eagle、MEM、RPMll640、DMEM 等。在各种合成培养基提供基础营养物质之外，还需根据不同细胞和不同的培养目的添加其他成分，如血清、因子等。血清提供的是细胞外基质、生长因子和转铁蛋白等重要物质，常用的是胎牛血清。10% - 20% 的血清能维持细胞较快的生长增殖速度，称为生长培养液；为维持细胞缓慢生长或不死，添加 2% - 5% 的血清即可，称为维持培养液。
无菌操作：为了避免污染，所有操作必须在无菌条件下进行，使用无菌的培养皿、移液器和试剂等。严格进行无菌操作，所用一切试剂及耗材均应无菌，且须在无菌超净工作台中紫外照射 30min 以上，以免细胞发生污染。常见的微生物污染有支原体、细菌、真菌。支原体无致死毒性，可与细胞长期共存，对细胞有潜在影响，但体积小，不易鉴别，可借助于地衣红或 Hoechst33342 染色来进行检测。细菌增殖快，在短时间内即可大量扩增，并产生毒素杀死细胞。真菌的种类繁多，肉眼可见，漂浮于培养液面上，可呈丝状、管状或树枝状等。
定期观察：定期观察细胞的形态、生长情况和代谢活动，及时发现并解决问题。
细胞传代：当细胞生长到一定密度时，需要进行传代，以维持细胞的生长和活力。
冻存：对于需要长期保存的细胞，可以采用冻存的方法，将细胞冻存在液氮中。细胞冻存和复苏的原则是：慢冻速融，这样更加有利于保持细胞的活力。冻存细胞不加任何保护剂，会导致细胞内冰晶的产生，从而使细胞产生内源性的机械损伤，引起细胞内环境渗透压，PH，电解质等的改变，进而促使细胞死亡。
（三）分类与特点
动物细胞培养：在所有的细胞离体培养中，动物细胞培养最困难。需要特殊条件，如血清（最常用小牛血清，提供生长必需因子，如激素、微量元素、矿物质和脂肪，相当于动物细胞离体培养的天然营养液）、支持物（大多数动物细胞有贴壁生长的习惯，离体培养常用玻璃，塑料等作为支持物）、气体交换（二氧化碳和氧气的比例要在细胞培养过程中不断进行调节，不断维持所需要的气体条件）。
植物细胞培养：
光照：离体培养的植物细胞对光照条件不甚严格，但光照不但与光合作用有关，而且与细胞分化有关。以获得植株为目的的早期植物细胞培养过程中，光照条件特别重要。以植物细胞离体培养方式获得重要物质时，植物细胞大多是在反应器中悬浮培养。
激素：植物细胞的分裂和生长特别需要植物激素的调节，促进生长的生长素和促进细胞分裂的分裂素是最基本的激素。植物细胞的分裂，生长，分化和个体生长周期都有相应的激素参与调节。和动物细胞相比，植物细胞离体培养对激素要求的原理已经了解，其应用技术也已相当成熟，已经有一套能使用的培养液。同时解决了植物细胞对水、营养物、激素、渗透压、酸碱度、微量元素等的需求。
微生物细胞培养：微生物多为单细胞生物，野生生存条件比较简单。所以微生物人工培养的条件比动植物细胞简单得多。其中厌氧微生物培养比好氧微生物复杂，因为严格厌氧需要维持二氧化碳等非氧的惰性气体浓度，而好氧微生物则只需要通过不断搅拌提供无菌氧气。微生物对培养条件要求不如动植物细胞那样苛刻，玉米浆、蛋白胨、麦芽汁、酵母膏等成为良好的微生物天然培养基。对于一些特殊微生物的营养条件要求，可以在这些天然培养基的基础上额外添加。
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