【生物工艺】动物细胞悬浮培养技术在兽用疫苗领域中的应用

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一、引言

动物细胞悬浮培养技术作为一种高效的细胞培养方法，在兽用疫苗生产等领域具有广泛的应用前景。本文将深入探讨动物细胞悬浮培养的优势、关键技术及应用领域，为相关研究和实践提供参考。

动物细胞悬浮培养技术是在生物反应器中，人工条件下对动物细胞进行大规模高效率培养的技术。随着生物技术的不断发展，该技术已广泛应用于病毒的大规模培养及兽用疫苗的制备。其优势主要体现在高效的生产效率、高质量的产品以及生物安全易掌控等方面。

细胞悬浮培养中用于体外培养的细胞绝大多数为动物源性，这使得该技术在兽用疫苗生产中得到了很好的运用。一方面，动物疫苗的生产需要考虑安全性、有效性和成本控制等因素，而动物细胞悬浮培养技术能够提高生产效率，确保生物产品质量可靠。另一方面，该技术可以根据不同的细胞和疫苗种类，选择合适的关键技术，实现灵活的优化生产。

二、动物细胞悬浮培养的优势

（一）高效的生产效率

动物细胞悬浮培养技术能够实现大规模高效率的细胞培养，提高生物制品的生产效率。通过生物反应器进行细胞悬浮培养，可以实现自动化控制和大规模生产，减少了人工操作和生产周期。与传统的转瓶培养方式相比，悬浮培养能够在相同的时间内培养更多的细胞，从而提高了生产效率。

例如，在兽用疫苗生产中，采用悬浮培养技术可以快速繁殖病毒，提高疫苗的产量。同时，悬浮培养技术还可以实现连续培养，进一步提高生产效率。

（二）高质量的产品

该技术有助于生产高质量的生物制品，确保产品的质量具有可靠性。动物细胞悬浮培养技术可以提供更加稳定的培养环境，有利于细胞的生长和代谢。同时，通过优化培养基和培养条件，可以提高细胞的活性和产物的表达量，从而提高产品的质量。

在兽用疫苗生产中，高质量的疫苗可以更好地保护动物免受疾病的侵害。悬浮培养技术可以生产出更加纯净、高效的疫苗，提高疫苗的安全性和有效性。

（三）生物安全易掌控

对生物安全容易掌控，降低了生产过程中的风险。动物细胞悬浮培养技术在封闭的生物反应器中进行，可以有效地控制培养环境，减少外界污染的风险。同时，通过对培养过程的实时监测和控制，可以及时发现和处理异常情况，确保生产过程的安全。

在兽用疫苗生产中，生物安全是至关重要的。悬浮培养技术可以降低疫苗生产过程中的污染风险，提高疫苗的质量和安全性。

（四）适用于兽用疫苗制备

在兽用疫苗的制备中得到了很好的运用，为动物疫病防控提供支持。动物细胞悬浮培养技术可以根据不同的疫苗种类和需求，选择合适的细胞系和培养条件，实现高效的疫苗生产。同时，悬浮培养技术还可以与其他技术相结合，如基因工程技术等，开发出更加高效、安全的兽用疫苗。

例如，在猪用疫苗生产中，悬浮培养技术可以快速繁殖病毒，提高疫苗的产量。同时，通过优化培养基和培养条件，可以提高疫苗的质量和安全性，为猪群的健康提供保障。

三、动物细胞悬浮培养的关键技术

（一）选择和悬浮驯化动物细胞系

与目标病毒进行适应性选择，确保细胞与病毒相互作用良好。在动物疫苗生产过程中，安全性、有效性和成本控制是关键考虑因素。同一种细胞和准备扩增的病毒之间会产生相互作用，因此在进行大规模疫苗生产前，应使细胞系与目标病毒进行相互适应性选择。

细胞生长特性决定培养工艺，不同培养状态下对病毒敏感程度不同。所选细胞的生长特性对能否进行大规模增殖培养以及使用哪种工艺进行增殖培养起着决定性作用。同一种细胞在不同培养状态下对病毒的敏感程度各异。

驯化悬浮细胞，保持活力在 90% 以上，满足大规模增殖培养要求。动物细胞悬浮培养技术对悬浮细胞的繁殖效率、活力以及生物稳定性有较高要求，驯化是细胞悬浮的首要任务，应使细胞活力维持在 90% 以上。

（二）最适培养基的选择

血清培养基存在弊端，逐渐被无血清培养基替代。一般情况下，动物细胞生长需要血清这种营养成分，但血清组成成分复杂、价格高昂且不同批次间成分差异较大，在实际疫苗生产中难以应用。目前，血清培养基已逐渐被无血清培养基替代，降低了污染情况和生产成本。

个性化无血培养基发展，加入特定生物活性物质促进细胞生长。由于细胞培养对培养基具有较高选择性，单一无血清培养基无法适用于多种细胞系培养，促使个性化无血培养基快速发展。可在无血清培养基中加入转铁蛋白、胰岛素或纤连蛋白等特定生物活性物质，促进动物细胞快速繁殖生长。

（三）选择恰当的生物反应器

生物反应器为细胞生长提供无菌环境，最大优势是逐级放大。生物反应器是细胞悬浮培养技术的关键设备，利用细胞或酶作为生物催化剂，为细胞生长繁殖提供无菌环境。其最大优势是能够进行逐级放大。

疫苗生产成本受生物反应器选择影响，需满足高生产效率、低成本等要求。疫苗生产的成本受生产细胞规模影响，生物反应器的选择直接影响疫苗生产成本。在疫苗生产中，对生物反应器的要求包括生产效率高、可靠性强、生产成本低、安全性能强、活性较强、便于控制质量和回收，同时具有较高的细胞密度。

常见生物反应器有流床式、气升式和旋转式细胞培养系统等。实际生产中应用较多的生物反应器有流床式生物反应器、气升式生物反应器和旋转式细胞培养系统等。

（四）生产工艺的选择

按照培养方式分为分批式、流加式、半连续式、连续式以及灌流式操作等模式。生产工艺按照培养方式可分为分批式、流加式、半连续式、连续式以及灌流式操作等几种模式。

不同生产工艺有各自特点和优势，对应不同生物反应器类型。不同的生产工艺具有自身特点与优势，同时对应不同的生物反应器类型。

根据培养细胞和疫苗种类灵活选择优化生产工艺。在实际生产过程中，可以根据所培养细胞的不同和所生产的疫苗种类，进行灵活的优化选择生产工艺。

四、动物细胞悬浮培养方法

（一）悬浮细胞传代方法

直接传代法：当细胞状态良好时，可采用直接传代法。具体操作是按比例分装原瓶培养基到新瓶，然后补加新鲜培养基。这种方法操作相对简单，能够快速实现细胞的传代，适用于细胞状态稳定、无明显细胞碎片且形态规则的情况。

离心传代法：若细胞状态较差，如细胞碎片较多、细胞形态不规则时，应采用离心传代法。首先，将细胞悬液转移到离心管内，以 1000rpm 离心 5min；然后弃去上层清液，轻轻地将细胞沉淀弹散，尽量避免使用吹打，以免导致细胞状态不好甚至死亡；最后使用新鲜的培养基重悬细胞，用吸管吸取适量细胞悬液，装入新的培养瓶，再加入适量的新鲜培养基，继续培养。

（二）CHO-K1 中国仓鼠卵巢细胞驯化及培养步骤

细胞简介及驯化前培养条件。

CHO-K1 中国仓鼠卵巢细胞（悬浮细胞），驯化前的培养基培养条件为 F12K 培养基（SIGMA，货号 N3520，添加 NaHCO32.5g/L）占 90%，优质胎牛血清占 10%。气相为空气占 95%，二氧化碳占 5%，温度为 37 摄氏度。

细胞株驯化过程，逐渐降低血清浓度至无血清培养。

复苏 CHO-K1 细胞转入 T25cm2 细胞培养瓶，以 F12K 基础培养基添加 10% 血清培养，待细胞长满单层后，加入 0.25% 胰蛋白酶消化，传代至装有完全培养基的 T25cm2 细胞培养瓶中继续培养，当细胞铺满瓶底时，即得贴壁 CHO-K1 细胞。取贴壁 CHO-K1 细胞，换液，加入 15mL 含血清的完全基和 15mL 无血清 CHO-K1 专用培养基，2 天后吸出一半培养液，加入等量的无血清 CHO-K1，每 2 天重复一次此操作，直到胎牛血清浓度低于 1% 后，以基础培养基 B001 继续培养，即培养基中血清浓度依次以 5%，2.5%，1.25%，0.625%，0% 降低。细胞在无血清 CHO-K1 专用培养基中密度达到 5×106cells/mL 时，即得悬浮 CHO-K1 细胞。

培养条件准备及细胞处理方法，包括冻存细胞复苏、传代和冻存。

（1）培养基及培养冻存条件准备：

准备：CHOGROWCD2 培养基 98%、GlutaMAX-1 谷氨酰胺 1%、P/S 青霉素 - 链霉素 1%。

培养条件：气相为空气占 95%，二氧化碳占 5%，温度为 37 摄氏度，培养箱湿度为 70%-80%。

冻存液：90% CHO-K1 专用培养基，10% DMSO，现用现配。

（2）细胞处理：

冻存细胞的复苏：将含有 1mL 细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含 4 - 6mL 完全培养基的离心管中混合均匀。在 1000RPM 条件下离心 3 - 5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含 6 - 8ml 完全培养基的培养瓶（或皿）中 37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

细胞传代：如果细胞密度达 80%-90%，即可进行传代培养。对于悬浮细胞，传代可参考以下方法：

方法一：收集细胞，1000RPM 条件下离心 4 分钟，弃去上清液，补加 1 - 2mL 培养液后吹匀，将细胞悬液按 1：2 到 1：5 的比例分到新的含 8ml 培养基的新皿中或者瓶中。

方法二：可选择半数换液方式，弃去半数培养基后，将剩余细胞悬起，将细胞悬液按 1：2 到 1：3 的比例分到新的含 8ml 培养基的新皿中或者瓶中。

细胞冻存：收到细胞后建议在培养前 3 代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。

五、动物细胞悬浮培养的应用领域

（一）兽用疫苗领域

国内生物制药现状，悬浮培养技术未广泛应用，仍以转瓶培养为主。

目前，国内兽用疫苗生产领域中，生物制药现状呈现出悬浮培养技术尚未得到广泛应用的特点，大部分企业仍以传统的转瓶培养方式为主。这种转瓶培养方式存在病毒产率低、生产成本高、劳动强度大等问题。而动物细胞悬浮培养技术作为一种高效的培养方式，虽然具有诸多优势，但在国内的应用仍处于起步阶段。

悬浮培养工艺关键技术，包括细胞与毒株驯化、个性化培养基研发、细胞培养工艺研发。

细胞与毒株驯化：为提高兽用生物制品的产率和安全有效性，在生物反应器中繁殖的病毒与细胞需要进行相互适应选择。针对不同的毒株及其表达量，筛选适合的宿主细胞对于细胞大规模生产具有重要意义。通常由高密度细胞培养转向低密度细胞培养，由高浓度血清培养逐渐降低血清浓度进行培养，在驯化过程中应注意保持细胞活力在 90% 以上，避免驯化后的细胞表达特性发生变化。

个性化培养基研发：在大规模培养技术中，维持细胞高密度甚至无血清生长，细胞培养基的营养含量对细胞的增殖、维持至关重要。我国目前销售的细胞培养基多为传统产品，难以满足生物反应器大规模培养动物细胞的技术要求。无血清培养基杜绝了血清的外源性污染和对细胞毒性作用，使产品易于纯化、回收率高，已成为国际生物制药生产的趋势。

细胞培养工艺研发：悬浮培养过程技术的开发和应用主要是生产工艺的开发和工艺过程优化，维持细胞生长和病毒繁殖的最优化环境控制。包括悬浮培养和微载体培养的选择，以及批培养、流加培养、灌注培养等培养方式的选择。

悬浮培养方式选择，如悬浮细胞培养和贴壁细胞微载体悬浮培养，以及批培养、流加培养、灌注培养的特点。

悬浮细胞培养和贴壁细胞微载体悬浮培养：悬浮细胞可以在反应器中直接生产增殖，细胞自由生长、培养环境均一、取样简单、培养操作简单可控、放大方便、污染率和成本低；而贴壁细胞在反应器中悬浮培养需要借助微载体，细胞和球体接触部位营养环境较差，培养、取样观察及放大工艺复杂，成本高。常见的微载体有实体的 Cytodex 微载体、片状的 DISK 微载体及多孔的 Cytopore 微载体。

批培养、流加培养、灌注培养的特点：批培养能直观反映细胞在生物反应器中的生长、代谢变化，操作简单，但初期代谢废产物较多，抑制细胞生长，细胞生长密度不高；流加培养操作简单、产率高、容易放大，应用广泛，但需要进行流加培养基的设计；灌注培养的培养体积小，回收体积大，产品在罐内停留时间短，可及时回收到低温下保存，利于保持产品的活性，但操作比较繁杂、细胞培养基利用效率低、旋转过滤器容易堵塞等。不同的病毒采用的培养方式不同，同一生物制品由于其营养环境的不同，生产工艺也可能发生变化。选择反应器悬浮培养工艺需要考虑细胞和病毒的关系、产物稳定性、细胞培养基或添加物的选择、细胞培养规模等几个因素。

六、总结

动物细胞悬浮培养技术在兽用疫苗生产等领域具有显著优势，关键技术的不断发展和完善将进一步推动其应用。未来，应继续深入研究和优化该技术，以满足生物制品生产的需求。

首先，动物细胞悬浮培养技术具有高效的生产效率、高质量的产品以及生物安全易掌控等优势，使其在兽用疫苗生产中得到了广泛应用。然而，目前国内该技术尚未得到广泛应用，仍以转瓶培养为主，存在病毒产率低、生产成本高、劳动强度大等问题。

为了更好地应用动物细胞悬浮培养技术，需要不断发展和完善关键技术。在选择和悬浮驯化动物细胞系方面，应与目标病毒进行适应性选择，确保细胞与病毒相互作用良好，同时驯化悬浮细胞，保持活力在 90% 以上。在最适培养基的选择方面，无血清培养基逐渐替代血清培养基，个性化无血培养基的发展为动物细胞的快速繁殖生长提供了支持。在选择恰当的生物反应器方面，生物反应器为细胞生长提供无菌环境，最大优势是逐级放大，应根据疫苗生产的要求选择合适的生物反应器。在生产工艺的选择方面，应根据培养细胞和疫苗种类灵活选择优化生产工艺。

未来，应继续深入研究动物细胞悬浮培养技术，进一步提高生产效率和产品质量，降低生产成本和生物安全风险。同时，应加强国际合作与交流，借鉴国外先进技术和经验，推动我国兽用疫苗生产技术的发展。此外，还应加大对该技术的研发投入，培养专业人才，为动物细胞悬浮培养技术的发展提供有力支持。

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