【细胞生物学】细胞破碎
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2024-12-10 08:09
上海
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一、细胞破碎技术简介
细胞破碎是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物释放出来的技术，是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质的基础。不同生物体或同一生物体不同部位的组织，细胞破碎的难易程度不同，需采用专门的细胞破碎方法。细胞破碎技术在生物工程领域具有重要意义。随着重组 DNA 技术和组织培养技术的发展，蛋白质的大规模生产成为可能，而细胞破碎技术则是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质（产品）的基础。为了研究细胞破碎，提高其破碎率，有必要了解各种微生物细胞壁的组成和结构。细胞壁结构对破碎的影响较大。微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞壁里面是细胞膜，动物细胞没有细胞壁，仅有细胞膜。通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁。不同细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就不同。例如，细菌的细胞壁主要由肽聚糖组成，这是一种难溶性的聚糖链，通过短肽交联形成网状结构，赋予细胞特定的形状和强度。细胞破碎的主要障碍在于肽聚糖的网状结构，其致密程度和强度取决于聚糖链上肽键的数量及其交联程度。酵母菌的细胞壁最里层由葡聚糖细纤维构成，形成刚性骨架，外部覆盖有一层糖蛋白，最外层则是甘露聚糖。细胞破碎的难度主要取决于壁结构的交联紧密度和厚度。真菌的细胞壁主要包括葡聚糖、几丁质和糖蛋白。最外层是葡聚糖混合物，第二层是糖蛋白网状结构，第三层主要是蛋白质，最内层是几丁质。细胞壁的强度不仅与聚合物的网状结构相关，还因含有几丁质或纤维素的纤维状结构而增强。植物细胞的细胞壁分为初生壁和次生壁两部分。初生壁由纤维素微纤丝和结构蛋白组成，形成纵横交错的网络结构。次生壁增加了纤维素和半纤维素的含量，使得细胞壁更加坚硬。机械法包括高压匀浆破碎法、振荡珠击破碎法、高速搅拌珠研磨破碎法、超声波破碎法等。高压匀浆器是常见的设备，由正向排代泵和排出阀组成，通过高压迫使细胞浆液在排出阀的小孔中高速冲出，射向撞击环，从而破碎细胞。操作方式灵活，可单次或多次循环通过，也可连续操作。为控制温度上升，可通过干冰调节入口温度。振荡珠击破碎法适用于处理少量样本，将组织样品与高密度珠子放入密封管中，加入缓冲液和稳定成分，通过高速振荡机进行破碎。研磨法是另一种常见方法，将细胞悬浮液与研磨剂快速搅拌，以破碎细胞。工业规模的破碎通常采用高速珠磨机。超声波破碎法利用超声波振荡器处理细胞悬浮液，振荡器分为槽式和探头直接插入介质两种形式，后者破碎效果更好。非机械法包括渗透压冲击破碎法、冻融破碎法、酶溶破碎法、化学破碎法、去垢剂破碎法等。渗透压冲击法是一种较为温和的破碎方法，通过改变细胞内外渗透压来破碎细胞。冻融破碎法将细胞置于低温环境冷冻，随后在室温下融化，反复多次以达到破壁的效果。酶解法利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，再利用其他方法破坏细胞膜，以提高胞内产物的通透性。蛋白质复性通过离心法分离包含体与细胞碎片，获得纯净的包含体，然后再对包含体进行溶解复性，这有助于简化后续的分离纯化过程。二、常见的细胞破碎技术
（一）高剪切均质乳化破碎细胞方法
高剪切均质机主要依靠转子高速运转产生的高速线速度，以及频率高的机械效应，伴随着强劲的动能，使组织或细胞在定子、转子之间非常狭窄的空隙中受到强烈的机械、液力剪切、液层摩擦、离心挤压、撞击撕裂和湍流等多种综合作用，从而造成细胞破碎。这种方法可用于多种细胞的破碎，如酵母细胞（毕赤酵母、酿酒酵母、汉逊酵母等）、大肠杆菌、结核杆菌、丝状真菌、人工倍体细胞、动物细胞、动物组织细胞、Vero 细胞、花粉、植物细胞、藻类等，用于提取胞内蛋白及核酸等。（二）组织捣碎机破碎细胞方法
将材料配成稀糊状液，放置于筒内约 1/3 体积，盖紧筒盖，把调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。一般适用于动物组织、植物肉质种子、柔嫩的叶芽等，转速可高达 10000rpm 以上，适合单次细胞破碎量在 50 - 1000mL 之间。但由于旋转刀片的机械切力较大，在制备一些较大分子如核酸时很少使用。（三）超声波破碎细胞方法
通过一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂。其原理主要包括热效应、空化效应和机械效应。该方法处理少量样本时，操作简便，重复性良好，节省时间，常用于微生物和组织细胞的破碎，如用大肠杆菌制备各种酶。不过，超声波产生的化学自由基团可能使某些敏感性活性物质变性失活；大容量装置在声能传递和散热方面存在困难，需要采取相应降温措施；对超声波敏感和核酸应谨慎使用。（四）组织匀浆器破碎细胞方法
先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨并上下移动，即可将细胞研碎。匀浆器的研钵磨球和玻璃管内壁之间间隙保持在十分之几毫米距离。这种方法细胞破碎程度高，适用于量少和动物脏器组织。然而，对于较易造成堵塞的团状或丝状真菌、较小的革兰氏阳性菌以及质地坚硬、易损伤匀浆阀的亚细胞器等不适用。（五）液氮研磨破碎细胞方法
将液氮预冻的样本放入研钵内研磨。操作时，所有接触实验样品的器具均需使用液氮预冷。由于是在低温条件下操作，需要操作者做好防护措施，如佩戴防冻手套、护目镜等，避免皮肤直接接触液氮，防止冻伤和液氮飞溅造成的伤害。此方法适用于量少和动物脏器组织等，但对于有些亚细胞器、质地坚硬的组织不适用。三、细胞破碎在科研中的应用
（一）DNA/RNA 提取
在分子生物学研究中，高效破碎细胞壁和核膜，释放细胞内的 DNA 或 RNA，为后续实验分析提供高质量核酸样本。超声波细胞破碎仪在这一过程中发挥着重要作用。它利用高频的超声波振动能量，在液体介质中产生高能量密度，从而引起细胞壁和核膜的破碎。相比传统的研磨或化学裂解方法，超声波破碎更加高效且破碎效果更均匀，能够在短时间内快速破碎大量细胞，确保细胞内的 DNA/RNA 得以充分释放。同时，超声波破碎是一种非热力学过程，避免了高温或强酸强碱等化学手段可能导致的核酸降解问题，使用超声波细胞粉碎机提取的 DNA/RNA 能够保持较高的完整性和纯度。通过调整超声波的参数（如频率、功率和时间等），可以灵活地控制破碎程度，从而根据实验需求优化提取效果。（二）核酸片段化
将大片段的 DNA 或 RNA 切割成较小片段，便于进行更精细的分析。超声波细胞破碎仪通过高频振动产生的剪切力，能够快速而均匀地切割核酸分子，生成所需长度的核酸片段。这对于研究核酸的结构、功能以及进行高通量测序等具有重要意义。（三）细胞器分离
进一步筛选和分离出细胞内的各种细胞器，用于深入研究其功能、代谢途径以及与疾病的关系等。超声波细胞破碎仪不仅可以破碎细胞，还能在细胞器分离过程中发挥作用。它可以使细胞破碎更加彻底，释放出细胞内的细胞器，然后通过差速离心、密度梯度离心等方法进一步分离和纯化细胞器。（四）蛋白质纯化与分析
将细胞内的蛋白质释放出来，并使蛋白质形成更小的颗粒，便于后续的纯化和分析。超声波细胞破碎仪同样能够有效地破碎细胞壁和细胞膜，释放出细胞内的蛋白质。其振动作用不仅可以破坏细胞结构，还可以影响蛋白质与其他分子的结合状态，使蛋白质更容易从与其结合的分子中分离出来，便于后续的纯化和研究。相比传统的提取方法，超声波细胞粉碎机能够更快速地完成蛋白质的提取过程，提高了蛋白质的提取效率。（五）微生物学研究
快速裂解微生物细胞壁，释放其中的蛋白质、核酸等大分子物质，有助于研究微生物的生理生化特性和资源开发利用。微生物学家可以使用超声波细胞破碎仪对细菌细胞进行破碎处理，释放细胞内的 DNA，用于基因测序、基因表达分析等研究。还可以利用超声波细胞破碎仪快速裂解微生物细胞壁，释放其中的蛋白质、核酸等大分子物质，研究微生物的生理生化特性，为微生物资源的开发利用提供技术支持。（六）纳米材料制备
将电能转化为声能，通过气泡炸裂产生的剪切力和冲击力，有效分散和破碎纳米材料。超声波细胞破碎仪在纳米材料制备领域展现出独特的优势。它可以将电能转化为声能，通过液体介质中的气泡炸裂产生强烈的剪切力和冲击力，从而有效地分散和破碎纳米材料。这种方法不仅提高了纳米材料的分散性和均匀性，还降低了制备过程中的能耗和成本。四、不同细胞破碎方法的优缺点
（一）高速组织捣碎
优点：适用于动物内脏组织、植物肉质种子等，通过高速旋转的刀片对物料进行切割、劈裂、碾碎等操作，能够快速处理一定量的样本。缺点：由于旋转刀片的机械切力较大，细胞破碎程度相对较低，且在制备一些较大分子如核酸时很少使用。（二）玻璃匀浆器匀浆
优点：细胞破碎程度比高速组织捣碎机高，通过研杆在管内来回研磨，上下移动，使细胞研碎，适用于量少和动物脏器组织。缺点：处理量有限，且较易造成堵塞，对于团状或丝状真菌、较小的革兰氏阳性菌以及质地坚硬、易损伤匀浆阀的亚细胞器等不适用。（三）超声波处理法
优点：处理少量样本操作简单，重复性好，利用超声波的热效应、空化效应和机械效应使细胞急剧震荡破裂，常用于微生物和组织细胞的破碎。缺点：处理过程会产生大量热，应采取相应降温措施，对超声波敏感和核酸应慎用。（四）反复冻融法
优点：操作简便，花费低廉，将细胞在低温下冷冻后再在室温下融解，反复几次使细胞结构破碎。缺点：速度慢，可能损伤敏感蛋白质或破坏蛋白质与细胞膜的相互作用，产量低，且反复冷冻 - 解冻循环波动会对食品等样本的品质造成严重影响。（五）化学处理法
优点：对某些动物细胞效果较好，可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等破坏细胞膜，细菌细胞壁较厚时可采用溶菌酶处理。缺点：可能影响细胞内其他物质，通用性差，且无论用哪种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量减少。五、高效细胞破碎手段
（一）超声波破碎仪
超声波破碎仪是一种常用的细胞破碎设备，其工作原理是利用超声波振动产生的高频机械波动力，对样品进行破碎、分散、乳化等处理。其内部核心部件包括压电陶瓷晶体、换能器、变幅杆及样品处理装置等。当高频电压施加于压电陶瓷晶体时，晶体会迅速振动并产生高频超声波。这些超声波通过换能器转换为机械振动，并由变幅杆传递至样品处理装置（如破碎杵、破碎管或破碎尖等）。在液体样品中，超声波的传播会产生交替的高压和低压区域，形成声波节点和反节点。在高压区域，液体分子受到挤压形成微小气泡；在低压区域，气泡迅速坍塌，产生局部高温和高压。这种被称为 “空化” 效应的现象，能够瞬间释放高能量，作用于样品中的细胞、分子或颗粒，从而实现破碎、分散或乳化。它在多个领域有着广泛的应用，几乎涵盖了所有需要样品破碎、分散或乳化的科研领域。在生物学研究中，可用于细胞破碎，提取细胞内的蛋白质、DNA、RNA 等生物分子；在医学领域，可用于结石破碎、制备细胞悬液、分离细胞器、破碎癌细胞等；在材料科学领域，可用于制备纳米材料，将大块材料破碎成纳米级小颗粒，有助于材料的表面改性和性能优化；在制药工业中，可用于制备药物原料、破碎药物颗粒以及提高药物溶解度等；在食品工业中，可用于乳化、分散、浸提、食品加工等；在环境科学领域，可用于处理废水、废液、土壤样品，以加速化学反应、降解污染物等。样品准备：确保样品状态适合破碎处理，如细胞浓度适中、样品均匀分散等。对于不同类型的样品，可能需要进行预处理，如离心、过滤等，以去除杂质或大颗粒物质，避免对超声波破碎效果产生影响。参数调整：根据样品特性和实验需求，合理设置超声波的功率、频率、处理时间、脉冲间隔等参数。一般来说，较低频率（如 20 - 25kHz）适用于较大细胞或较硬组织的破碎，较高频率（如 40 - 60kHz）则更适合较小细胞或较脆弱样品的处理。功率和处理时间应根据样品量和破碎难度进行优化，避免过度破碎或破碎不完全。同时，可采用短时多次超声辐射的方式，既能提高破碎效果，又能减少对样品的热损伤。设备维护：定期清洁换能器表面，防止样品残留和杂质积累影响超声效果。检查连接部件是否松动，确保设备正常运行。注意设备的散热情况，避免长时间连续使用导致过热损坏。对于配备隔音箱的设备，要保持隔音箱内部清洁，检查隔音材料是否完好。安全防护：操作人员应佩戴耳塞或耳罩，以降低超声波对听力的损害。避免直接接触超声波发射部位，防止超声波对人体造成潜在伤害。在操作过程中，要确保设备接地良好，防止漏电事故发生。技术特点方面，超声波破碎仪具有高效快捷的优势，能够在短时间内实现样品的快速破碎和均质化，大大提高了实验或生产效率。适用范围广泛，可处理多种类型的样品，包括细胞、组织、细菌、病毒、纳米材料等，且对不同性质和硬度的样品均有较好的破碎效果。操作相对简便，只需设置好相关参数即可启动设备，无需复杂的操作流程和专业技能。非接触式超声波破碎仪采用全封闭系统，有效避免了样品间的交叉污染，保证了实验结果的准确性和可靠性，同时减少了化学试剂的使用，降低了对环境的污染。（二）非接触式超声波破碎仪
非接触式超声波破碎仪在多种情况下都非常适合使用，其主要优势在于其非接触性、高效性、无污染性和多功能性。在生物医药领域，如处理病毒、细菌等微生物时，非接触式超声波破碎仪可以避免样品与设备直接接触，从而减少污染的风险。同时处理多个样品时，它可以确保各样品在独立的全封闭试管中处理，有效避免样品之间的交叉污染。在药物开发、疫苗制备、基因组学、蛋白质组学等研究中，该仪器能够高效、快速地破碎细胞，释放其中的生物分子。在材料科学、环境科学等领域，可用于破碎颗粒状物质，如土壤、矿石等。它还可用于无菌操作、多样品处理、细胞破碎、颗粒破碎、均匀破碎、精细控制、减少化学试剂使用、在空间有限或环境条件特殊的实验室或生产环境中工作以及中等规模样品处理任务等多种场景。与传统接触式超声波破碎仪相比，非接触式超声波破碎仪具有诸多优势。它采用全封闭系统，避免了样品与外界环境的接触，有效防止了交叉污染，确保实验结果的准确性和可靠性。通常一次可同时处理多个样品（如 4 - 16 个，具体数量依型号而定），大大提高了实验效率，且无需频繁操作探头，减少了人为错误和操作时间。通过超声波在密闭容器中的传播实现细胞破碎，能量分布均匀，能提高细胞破碎的一致性和效果，减少对细胞的物理损伤，特别适用于脆弱细胞类型。配备智能化控制系统，用户可根据需求调整超声功率、处理时间等参数，并实现实验步骤标准化，提高实验重复性和结果可靠性。封闭系统减少了超声过程中气雾或泡沫扩散风险，增强生物安全性。不仅适用于常规细胞破碎等应用，还是土壤样品制备、病毒 DNA 提取、CHIP（染色质免疫共沉淀）研究平台等领域的理想工具。当然，非接触式超声波破碎仪也存在一些缺点。设备成本相对较高，其设计和制造复杂，导致价格较贵。操作复杂性较高，操作人员需熟练掌握各项参数设置以达最佳破碎效果，对技术水平要求较高。维护和保养难度较大，因其结构复杂，需定期清洁、校准和维修以保正常运行和延长寿命。破碎效率受超声波频率、功率、作用时间及样品性质等多因素影响，不同实验条件下破碎效果可能不稳定。运行时会产生一定噪音，可能干扰实验环境，尤其在安静实验室中较为明显。赶紧扫码入群，解锁更多惊喜
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