Adv Sci︱南方科技大学万峻/潘杰报道小胶质细胞清除β-淀粉样蛋白的新靶点:C型溶菌酶样蛋白4

学术   2024-11-27 00:00   上海  

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撰文钟杰

审阅︱潘杰,万峻

责编︱王思珍

β-淀粉样蛋白Amyloid-β)是阿尔茨海默病Alzheimer's Disease, AD)的关键病理特征之一[1]的异常积聚形成的毒性斑块可引起突触损伤、增强氧化应激,并诱发局部免疫反应[2]小胶质细胞在维持脑稳态及清除病理性斑块方面发挥着重要作用,许多与AD及其他神经退行性疾病风险增加相关的基因都在小胶质细胞中表达。此外,已知溶菌酶(Lysozymes)在果蝇、AD小鼠模型和人类AD病例中对病理具有保护作用[3-5]然而,与溶菌酶在结构和酶学特性上相似的溶菌酶样蛋白(lysozyme-like proteins)在中枢神经系统内的确切功能,特别是在AD背景下,仍未被充分揭示。


近日,南方科技大学生命科学院的万峻/潘杰团队在Advanced Science杂志上发表了题为“Microglial Lyzl4 Facilitates β-Amyloid Clearance in Alzheimer’s Disease”的论文。该研究首次揭示了小胶质细胞中C型溶菌酶样蛋白4Lyzl4)在AD中促进清除的重要作用,并提出了Lyzl4作为AD治疗靶点的可能。



首先,为了筛选与AD进程密切相关的关键基因,研究团队对不同月龄(2469 12 个月)的 APP/PS1AD模型小鼠)和野生型(WT)小鼠的小胶质细胞进行了RNA测序分析。通过加权基因共表达网络分析(WGCNA),发现Lyzl4 是与AD进展和小鼠年龄显著相关的基因(图1 A-C。研究人员进一步通过qPCRRNAscope技术验证了Lyzl4AD模型小鼠中的表达显著高于WT小鼠(图1 D-F。随后,通过对C型溶菌酶样蛋白家族的分析,发现Lyzl4 是该家族中唯一在脑组织表达的成员,并在不同物种间具有较高的保守性,氨基酸序列同源性约为60%此外,免疫荧光结果提示无论在BV2小胶质细胞细胞系还是在原代分离的小胶质细胞中Lyzl4都主要分布于溶酶体中,这为其参与降解提供了直接的线索。


1  APP/PS1 小鼠小胶质细胞中 Lyzl4 的上调

为探讨Lyzl4表达的影响,研究人员利用寡聚化的Aβ1-42对体外培养的BV2细胞和原代小胶质细胞进行刺激。结果显示,在BV2细胞中,当暴露于浓度为24 μMAβ1-42寡聚体,长达100小时后,Lyzl4的表达水平显著上调(图2 A。相比之下,原代小胶质细胞对Aβ1-42的刺激更为敏感。当使用浓度为12 μMAβ1-42寡聚体刺激时,仅需24小时即可观察到Lyzl4表达的显著增加,并在60小时和100小时也出现上调(图2 B这些结果表明,寡聚体可诱导小胶质细胞中Lyzl4的表达。


 Aβ寡聚体处理小胶质细胞后, Lyzl4 表达表现出时间过程和剂量依赖性。

为研究Lyzl4清除能力的影响,研究人员通过pHrodo标记技术在体外动态观察了小胶质细胞对的吞噬过程。实验结果表明,在与pHrodo-Polybead-Amino微球共培养的实验中,无论是对照组还是Lyzl4过表达组,GFP+细胞的比例均无显著差异(图3E这提示Lyzl4不会影响小胶质细胞整体的吞噬能力。然而,当与pHrodo-Aβ寡聚体共培养时,Lyzl4过表达组的GFP+细胞比例在培养16小时后开始下降,并在24小时时显著低于对照组(图3F。相比之下,在吞噬受损的细胞松弛素 D处理组中, GFP+细胞的百分比在所有时间点都接近于零。进一步采用ELISA法检测浓度,结果显示,Lyzl4过表达组小胶质细胞内的浓度显著低于对照组。而在两组上清液中,水平都非常低,提示细胞外被小胶质细胞摄取,并且其摄取率不受 Lyzl4 过表达的影响(图3G这些结果证实了Lyzl4过表达可以显著提高小胶质细胞对的清除能力,而非吞噬能力。研究人员同时也对原代小胶质细胞中做了Lyzl4的敲减实验(图3H,然后使用1 μm Aβ1-42 寡聚体处理小胶质细胞。结果发现在敲低组或对照组中,阳性小胶质细胞的比例都在前 18 小时内稳步增加,然后在 24 小时下降,提示在细胞内被降解。然而,Lyzl4 敲低组和对照组之间没有观察到显着差异(图3I这提示仅抑制 Lyzl4 不足以抑制小胶质细胞清除功能,可能还有其他补偿机制在起作用。


原代小胶质细胞中 Lyzl4 的过表达增强了 Aβ 的清除率,而不会改变吞噬作用。

为验证Lyzl4对体内的清除效果,研究人员通过腺相关病毒(AAV)将Lyzl4基因特异性表达于小胶质细胞中,并注射至APP/PS1小鼠的脑中(图4A-B。通过比较AAV-Lyzl4 AAV-NC 半侧脑之间的GFP+区域),发现AAV-Lyzl4 组的斑块显著减少且变小(图4C-E,而每个斑块中的小胶质细胞数量无明显差异(图4F。相应地,ELISA 结果显示皮层水平在 AAV-Lyzl4 组显著降低(图4G。这些结果提示在体内Lyzl4 不是通过增加斑块周围的小胶质细胞数量来减轻负担的,而是通过增强小胶质细胞清除能力来减轻负担。此外,研究人员还通过FACS分离小胶质细胞并检测促炎因子的水平(图4H,结果显示Lyzl4过表达组的促炎因子(如TNF-αIL-1βIL-12)显著降低(图4I这提示Lyzl4在体内不仅是促进被清除,还可能通过调控小胶质细胞的炎症反应发挥保护作用。


4 Lyzl4 促进体内小胶质细胞清除 Aβ 斑块

关于Lyzl4促进降解机制的初步探究,研究人员观察了Lyzl4与早期内体(EEA1)、晚期内体(Rab7)和溶酶体(Lamp1)的共定位情况。结果显示,主要与Rab7Lamp1共定位,而非EEA1,表明Lyzl4可能通过调控向晚期内体和溶酶体的转运过程来促进的清除。


图5 总结图

文章结论与讨论,启发与展望
综上所述,该研究结合生物信息学、分子生物学、细胞生物学、模式生物等首次揭示了AD中小胶质细胞的Lyzl4清除的重要作用。研究表明 Aβ 刺激可诱导小胶质细胞从稳定状态转变为以 Lyzl4 上调为特征的激活表型。反过来,上调的 Lyzl4 表达又增强了体内和体外小胶质细胞对 Aβ 的清除能力(图5。该研究为小胶质细胞清除 Aβ 的分子机制提供了可能的切入点。然而,本研究也存在一定局限性。首先,尽管Lyzl4对于的清除作用得到了体内外实验的支持,但分子机制尚未完全阐明;其次,本研究未能直接评估Lyzl4AD小鼠认知功能的影响,未来还需要结合行为学实验进一步评估。

原文链接:https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202412184

斯坦福大学的潘杰博士和深圳北京大学香港科技大学医学中心博士生钟杰为共同第一作者。该研究得到了深圳北京大学香港科技大学医学中心和南方科技大学的支持和帮助。



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参考文献
[1] R. A. Stelzmann, H. Norman Schnitzlein, F. R. Murtagh, Clin. Anat. 1995, 8, 429.

[2] S. Tiwari, V. Atluri, A. Kaushik, A. Yndart, M. Nair, Int. J. Nanomed. 2019, 2019, 5541.

[3] L. Sandin, L. Bergkvist, S. Nath, C. Kielkopf, C. Janefjord, L. Helmfors, H. Zetterberg, K. Blennow, H. Li, C. Nilsberth, B. Garner, A.-C. Brorsson, K. Kågedal, FEBS J. 2016, 283, 3508.

[4] L. Helmfors, A. Boman, L. Civitelli, S. Nath, L. Sandin, C. Janefjord, H. McCann, H. Zetterberg, K. Blennow, G. Halliday, A.-C. Brorsson, K. Kågedal, Neurobiol. Dis. 2015, 83, 122.

[5] J. Luo, S. K. T. S. Wärmländer, A. Gräslund, J. P. Abrahams, Chem. Commun. (Camb). 2013, 49, 6507.

编辑︱王思珍
本文完

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