基因敲入技术应用与前景
CRISPR基因敲入技术分2步：首先，gRNA和Cas9复合物在基因序列特定位置切割产生双链断裂；然后，基于同源重组介导修复机制（HDR），利用包含目的序列的同源修复模板，实现目的序列敲入双链断裂处。
基因敲入可用于以下研究领域：
细胞疗法开发：CAR或TCR等序列的插入
细胞/动物模型制备：病理研究、药物筛选与评价
目的基因过表达或示踪基因表达：生理状态下开展动态研究
精准简单！
金斯瑞CRISPR基因敲入设计工具
金斯瑞专业的CRISPR科学家、生信、IT团队协作开发了CRISPR基因敲入设计工具，免费设计和提供基因敲入实验所需sgRNA和基因敲入模板序列，功能完善，设计精准，操作简单，可以满足资深CRISPR实验专家复杂的基因敲入要求，也可以让CRISPR实验初学者快速上手完成基因敲入设计。
CRISPR基因敲入设计工具地址：
https://www.genscript.com.cn/tools/gRNA-design-tool/hdr_knock_in
或登录金斯瑞官网，点击菜单栏“试剂服务” → “CRISPR/Cas9基因编辑” → “设计工具”
CRISPR基因敲入设计工具的优势
1. 覆盖更广泛的应用
10个常用物种，Cas9/Cas12a编辑体系，单链/双链/环状敲入模板设计
2. 具备更强大的功能
长达1.5kb的敲除和长达20kb的敲入实验的设计，24种标签和linker可选
3. 提升基因敲入效率
更新的On Target和Off Target评分逻辑，silent mutation功能，CTS设计，优化的同源臂设计，提供输入序列正确性检验功能
CRISPR基因敲入设计使用指南
第一步 - 选择敲入基因信息
选择物种、核酸酶类型（Cas9或Cas12a）、待敲入位点的基因ID、Transcript ID
如果有特定的敲入位点，可以输入敲入位点信息，例如：28725099（无需输入chr#）- 可选
如果需要使用特定的gRNA，可以输入gRNA序列（仅需输入19-20引导序列，不需输入骨架序列）- 可选
可以自定义输入设计名称，后续下载Excel结果时，文件名称即以自定义名称命名 - 可选
第二步 - 输入敲入序列信息
1）点击“缩放图谱”按钮，即可展开序列图，显示每一个碱基的信息
2）序列图中绿色的竖线代表编辑位点，将鼠标放在绿色竖线上，当鼠标变成十字箭头后，可以将绿色竖线向左右拉开，选择需要替换的序列范围，也可以在“删除片段长度”方框中输入需删除序列长度信息：
针对序列删除：请通过移动绿色编辑位点或输入“删除序列长度”的方式选择需要删除的序列（删除序列显示为灰色），直接在“敲入序列”的方框内删除原来的序列
针对序列敲入：请直接通过移动绿色编辑位点或输入编辑位点的方式选择敲入位点，直接在“敲入序列”的方框内输入需要敲入的序列（敲入序列显示为橙色）
针对序列替换：选择需要删除的序列，在“敲入序列”的方框内删除原来的序列，并输入需要敲入的序列
3）软件提供24种常用标签和Linker，请选择所需标签或Linker，点击“插入”按钮，确认标签名称输入在“敲入序列”的方框中
如果图谱中序列上的箭头向左，则代表基因位于“-链”，请选择带有（-）的标签或Linker
如果图谱中序列上的箭头向右，则代表基因位于“+链”，请选择带有（+）的标签或Linker
4）可以选择Silent Mutation功能，对序列进行同义突变，防止sgRNA再次切割编辑后的序列，从而提升基因敲入效率 - 可选
5）针对ssDNA，可以选择增加CTS设计，即在5‘端增加Cas酶结合位序列，与退火引物一起使用，可以将RNP（Cas酶+sgRNA）结合至ssDNA，提升共同递送效率，从而提升敲入效率 - 可选
第三步 - 选择合适的基因敲入模板
设计软件提供以下参数供您参考：
On Target评分：更高的数值代表具有更高的编辑效率
Off Target评分：更高的数值代表具有更高的脱靶效应
与敲入位点的距离：代表实际的敲入位点和理论的敲入位点之间的碱基数，理论上数值越小越好，但当“与敲入位点的距离“小于20时，我们推荐On Target评分更高，GC%在40-80%的sgRNA
设计软件提供多种基因敲入模板供您选择：
ssDNA：150nt-5kb，细胞毒性低，基因敲入效率高，细胞疗法开发优选
dsDNA：1-10kb，双端共价封闭更稳定，较之PCR dsDNA基因敲入效率更高
GenCircle dsDNA：1-20kb，环状模板，骨架仅429 bp，不含抗性基因，较之常规质粒基因敲入效率更高
第四步 – 订购sgRNA和基因敲入模板
下载Excel格式的sgRNA和基因敲入模板设计结果，内附具体序列
选择同一组的sgRNA和基因敲入模板进入订购页，选择纯度、交付量、交付形式即可报价或询单
设计软件的每个选项、参数旁边都有问号标识，点击问号即可展示相关的释义信息，帮助您理解和顺畅的操作。
提升敲入效率！
金斯瑞单链/双链/环状基因敲入模版
金斯瑞提供多种基因敲入模板，可以支持不同长度（1-20kb）、不同交付量（μg-g）的基因敲入模板的需求，具有敲入效率高、脱靶效应低的优势。同时还提供基因敲入优化试剂盒，可用于优化基因敲入实验或作为阳性对照。
金斯瑞GenExactTM ssDNA
经实验验证ssDNA对免疫原代细胞毒性低，区别于传统PCR制备ssDNA等方式，金斯瑞GenExactTM ssDNA基于独特的恒温酶法制备，已获得获国家知识产权局发明专利授权，并具备以下优势：
长达6kb、μg-500mg、定制化QC、支持科研至GMP级别
无荧光染料/PCR dsDNA等残留、animal & cell-free
纯度高、深度去除杂质、序列正确性保证
经验证敲入效率高、细胞毒性低、脱靶效应低
在非病毒细胞疗法依托安全、高效、经济等优势日益发展的当下，GenExactTM ssDNA是CAR / TCR等序列模板定向敲入T / NK / iPSC细胞等的理想选择。
金斯瑞GenExactTM ssDNA的质量优势与验证数据
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备注：基因敲入实验采用Thermo Neon电转平台
金斯瑞GenWandTM dsDNA
双链DNA 是CRISPR技术中通过同源介导修复 (HDR) 进行基因敲入的理想模板之一，实验室自制的PCR dsDNA存在稳定性差、敲入效率低的弊端，金斯瑞研发GenWand™ dsDNA则攻克了以上难题，尤其适合长基因的敲入或大规格的需求，并具备以下优势：
1-10 kb、μg-g交付量、定制QC、支持科研至GMP级别
双端共价封闭，更稳定、随机插入更少
大规格性价比高、敲入效率高、脱靶效应低
纯度高、深度去除杂质、序列正确性保证
金斯瑞GenWandTM dsDNA的质量优势与验证数据
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金斯瑞GenCircleTM dsDNA
金斯瑞开发的GenCircleTM dsDNA，是一种不含抗生素抗性基因、细菌源性序列的小型环状双链DNA载体，可用于搭载目的基因，骨架序列长度仅为常规迷你质粒载体的约1/4，可用于CRISPR基因敲入模板、转座子/转座酶载体、AAV/慢病毒包装质粒、非病毒载体、mRNA制备模板等，支持科研至GMP级别，并具备以下优势：
更安全！不含抗性标记基因，不在生产菌株以外复制
更简单！去除CpG岛等细菌源序列，免疫原性/毒性更低
更小巧！载体骨架仅400bp+，保真性好，转染效率高
更高效！提升敲入/转座效率、病毒滴度、转录/表达水平
金斯瑞GenCircleTM dsDNA的质量优势与验证数据
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金斯瑞基因敲入优化试剂盒
在基于CRISPR技术的非病毒细胞疗法开发中，科学家需要优化实验体系获得更高的CAR序列敲入效率。金斯瑞推出了CRISPR基因敲入优化试剂盒，用于优化基因敲入实验或作为阳性对照，具有周期快、更经济、敲入效率经验证的优势，该试剂盒包含以下4个组分，可任选一个或多个：
1. SafeEdit sgRNA (HPLC纯化)
TRAC位点（适用于T细胞）、Rab11a位点（适用T/NK/iPSC等细胞）敲入位点可选
2. Cas9蛋白
野生型（WTSpCas9）、增强型（eSpCas9）可选
3. 基因敲入（HDR）模板
ssDNA、dsDNA敲入模板可选（也可选择同时测试），可选择通过增加CTS序列，让RNP（Cas9+sgRNA）结合至敲入模板，促进模板进入细胞核，提升敲入效率，UCSF通过CTS序列设计可将敲入效率提升至78%
4. 基因敲入增强剂（Enhancer）
经验证在多个细胞系和位点，可将GFP序列敲入效率提升2.4倍
金斯瑞基因敲入优化试剂盒验证数据
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欢迎咨询金斯瑞CRISPR基因敲入设计软件、单链/双链/环状基因敲入模板服务，专业技术支持为您服务：
邮件：oligo@genscript.com.cn
电话：400-025-8686转5812或5815
