期刊：Theranostics
影响因子：12.4
伯豪技术服务：单细胞核转录组测序、伯优®细胞核分离试剂盒
研究背景
靶向程序性细胞死亡PD-1/PD-Ll通路的免疫检查点抑制剂在黑色素瘤患者的治疗中发挥重要作用。然而，仍有大部分患者发生原发或继发耐药，严重影响患者生存。最近的单细胞RNA测序研究表明黑色素瘤表现出肿瘤细胞、免疫细胞和间质细胞的独特转录特征，包括肿瘤细胞抗原提呈功能的丧失、CD8+T细胞和成纤维细胞分泌的细胞外基质的耗竭等，可导致对免疫检查点抑制剂的耐药。然而，对肿瘤免疫有益的细胞亚群的鉴定及免疫治疗预测模型的构建仍然有待进一步研究。
研究技术
单细胞核转录组测序、多重免疫荧光等
（部分技术服务由伯豪生物提供）
研究内容
利用PD-1单抗新辅助治疗恶性黑色素瘤临床试验收集的治疗前后配对标本，本研究发现了与PD-1单抗疗效密切相关的4种细胞亚群。通过细胞间通讯网络的绘制，阐明了该四种细胞亚群的相互作用有助于抗肿瘤免疫。阐明了黑色素瘤PD-1单抗耐药的主要机制。此外，基于这四个亚群新开发的预测模型，可以高效评估PD-1单抗治疗疗效。
研究模式图
主要研究结果
1. 新辅助免疫治疗黑色素瘤患者的单细胞转录组图谱
通过对19例恶性黑色素瘤样本（3例PD，4对pRR, 4对pNR）的单细胞核测序分析，共提取了100554个单细胞测序数据。利用典型标记基因的平均表达水平，共注释并识别出黑色素瘤细胞、免疫细胞、成纤维细胞和内皮细胞，以及上皮细胞等细胞类型(图1A-H)。Heatmap特征图和小提琴图显示，CNV评分在黑色素瘤细胞中升高(图1F和G)。特征表达基因的数量和总基因计数也在黑色素瘤细胞中富集(图1H和I)。这些结果表明了我们的细胞类型的准确性，可用于后续分析。我们比较了这些细胞类型的比例，发现PD-pre组的淋巴细胞(包括CD4+ T、CD8+ T、NK/NKT和B细胞)数量低于NPD-pre组(图1I)。在PD-pre组患者中，B细胞比例显著下降(p < 0.05)，而髓系细胞比例显著增加(图1J)。所有这些发现表明，无应答患者的TME受到抑制。NPD组经PD-1单抗治疗后CD8+ T细胞显著升高，而pDCs显著下降(图1K)。
2. MM_Immune亚群降低预示PD-1单抗治疗不敏感
我们对黑色素瘤细胞进行了无监督的再聚类。56 664个黑素瘤细胞分为41个簇(图2A)，通过GO分析确定其生物学功能，并将其分为5个初级亚组。包括MM_Immune, MM_Epithelial-mesenchymal transition (EMT)、MM_Proliferation、MM_Stress和MM_Unknown(图2B)。MM_Immune亚组参与抗原提呈和淋巴细胞趋化，其细胞比例在NPD-pre组显著高于PD-pre组(图2C-D)。在伪时间轨迹中，MM_Immune细胞主要位于系统发生树的开始，并在发育过程中逐渐减少(图2F)。这些结果表明，MM_Immune细胞代表了最初的肿瘤细胞发生转化，并发展成具有替代功能的细胞亚群。同时，MM_Immune细胞失去了抗原提呈特性，这与ICIs治疗经常导致耐药结局的临床现象有关(图2G)。值得注意的是，我们发现PD-pre组的肿瘤细胞主要聚集在cell fate 1，而NPD-pre组的肿瘤细胞主要聚集在pre-branch和cell fate 2(图2H)。为了研究这一现象，我们对初始支、cell fate 1和cell fate 2进行了基因表达分析，表明初始支在功能上与免疫相关，而cell fate 1富集在细胞外基质、黏附、WNT和其他通路，cell fate 2主要集中在凋亡和基质金属蛋白酶通路(图2I)。黑素瘤细胞通过异常激活细胞外基质、WNT和其他途径降低抗PD-1治疗的疗效。在免疫治疗的患者中，TCIA高评分组患者的生存率高于低评分组(图2J)。这些结果表明，MM_Immune细胞比例可能成为预测患者免疫疗效的一个新的生物标志物。
3. CD74+ follicular B，cDC2_RTN1，iCAF-CCL21亚群与免疫治疗敏感性密切相关
通过类似的分析手段，我们筛选出CD74+ follicular B，cDC2_RTN1，iCAF-CCL21等非肿瘤细胞亚群在免疫治疗中亦发挥重要作用，并通过多重免疫荧光进行了进一步验证（详见原文）。为了检测TME中不同细胞类型之间的相互作用，我们研究了细胞-细胞相互作用网络。与PD-pre组相比，NPD-pre组观察到更多的沟通和免疫相关信号(图3A和B)。具体而言，在PD-pre组中，MM_Immune细胞是主要的信号发送者，而CD8+T细胞是主要的信号接收者。在NPD-pre组中，MM_Immune、B_CD74、CD8+T和iCAF_CCL21细胞被确定为主要的信号发送者，而CD8+T和B_CD74细胞是主要的信号接收者(图3B和C)。值得注意的是，在NPD-pre组中检测到大量免疫相关的相互作用，如免疫相关信号通路的大幅增加所示(图3D和E)。在PD-pre组和NPD-pre组之间细胞间通讯差异的模式图中，可以看到，B_CD74细胞被iCAF_CCL21细胞募集并被补体途径激活，cDC2_RTN1细胞也是如此。iCAF_CCL21细胞缺失可能导致PD-pre组B细胞募集和活化减少(图3F)。
4. 免疫预测模型的构建与验证
为了更好地预测黑色素瘤免疫治疗的疗效，我们使用已发表的数据探索了ICIs队列的大量RNA-Seq结果构建了训练集(n = 195)和测试集(n = 49) (图4A)。并利用四种免疫激活亚群的标记物构建了四个单独基因集和一个综合基因集。在利用训练集构建的35个模型中，“adaboost”模型的AUC值最高，为0.95(图4B-D)。我们将该模型与同一队列中报道的最佳模型进行比较，发现我们的模型在抗PD-1应答预测能力方面具有更高的AUC(图4G)。使用该模型，免疫治疗低危亚组表现出显著（p < 0.001）延长的总生存期(图4F)。
参考文献：
Sun W, Zhu Y, Zou Z, Wang L, Zhong J, Shen K, Lin X, Gao Z, Liu W, Li Y, Xu Y, Ren M, Hu T, Wei C, Gu J, Chen Y. An advanced comprehensive muti-cell-type-specific model for predicting anti-PD-1 therapeutic effect in melanoma. Theranostics 2024; 14(5):2127-2150.doi:10.7150/thno.91626.https://www.thno.org/v14p2127.htm
关于snRNA-seq研究方法
在snRNA-seq的实验过程中，获取足够数量的高纯度细胞核，是建库，及影响后续测序分析的关键步骤。低质量的细胞核会显著降低文库的质量，甚至可能直接导致建库的失败。
本研究所使用的伯优®细胞核分离试剂盒是由伯豪生物独立研究开发的产品。
产品优势
最大限度地维持细胞核膜的完整和染色质的空间结构稳定性得率高，杂质少，不易成团。
产品应用
表观遗传学研究（如scATAC- seq/bulk ATAC- seq，CUT&Tag）；
核转录组测序（snRNA-seq/bulk RNA-seq）等；
结果参考
产品列表
更多相关信息和产品欢迎
联系我们获取
推荐阅读
本文为伯豪生物原创
欢迎转发朋友圈
转载请注明来自伯豪生物
咨询热线：17702139967
邮箱：market@shbio.com
发现“分享”和“赞”了吗，戳我看看吧
