内质网 (Endoplasmic Reticulum, ER) 是真核细胞内一种广泛存在的内膜系统，具有多种重要的生物学功能，包括蛋白质合成、运输、折叠及修饰，脂质合成，钙离子储存及释放，细胞器互作网络的构建(Bravo et al, 2013; Schröder, 2008; Zhang & Hu, 2016)。内质网自噬（ER-phagy）作为一种选择性自噬形式，通过自噬溶酶体降解内质网特定组分，是维持内质网动态平衡的重要机制。在基础状态下，ER-phagy保持活跃，精细调控ER大小和功能 (Chino & Mizushima, 2020; Dikic, 2018; Grumati et al, 2018; Molinari, 2021)。面对钙离子波动、错误蛋白质积累或氧化还原电位变化等应激条件，ER-phagy快速响应，通过降解蛋白质聚集体和修剪过剩膜结构，有效维持细胞内稳态。尽管ER-phagy在细胞稳态和应激响应中扮演关键角色，但不同细胞类型、组织和器官中的具体调控机制仍知之甚少。这在很大程度上源于缺乏有效的体内示踪工具，限制了对其深入的机制和功能研究。近日，来自浙江大学国际健康医学研究院的孙启明团队在Journal of Cell Biology杂志上在线发表的研究论文，并被选为2024年12月同期封面文章。他们基于串联荧光探针系统（tandem RFP-GFP）建立体内细胞的内质网自噬示踪技术，使得在体内以单细胞分辨率进行ER-phagy和ER结构的精确时空测量成为可能，系统探讨了不同器官、组织及原代细胞ER-phagy的差异。研究还发现，在饥饿、致癌转化和组织损伤等应激条件下，不同组织的ER-phagy和ER结构发生显著重塑。为了示踪体内细胞及组织器官的ER结构及ER-phagy活性，研究人员比较了三种不同的内质网自噬探针RFP-GFP-RAMP4、RFP-GFP-REEP5、ssRFP-GFP-KDEL，分别标记片状、管状或整体ER，并构建相应的荧光报告小鼠。串联荧光蛋白RFP-GFP作为自噬领域常用的报告蛋白，在酸性环境下的荧光变化被用来量化ER-phagy。该探针的工作原理如下：当RFP-GFP被用作报告蛋白时，ER同时以绿色和红色标记；而内质网自噬时，ER片段的RFP荧光在酸性溶酶体中保持稳定，而GFP荧光淬灭，产生单红色信号。研究人员最终选用了ssRFP-GFP-KDEL作为ER标记序列，并构建了一种组成型荧光报告小鼠ER-TRG（ER lumen-targeting tandem RFP-GFP, CAG-loxP-Stop-loxP-ssRFP-GFP-KDEL），通过检测不同类型细胞、组织器官中RFP-GFP的表达，发现ER-TRG小鼠能够很好标记体内ER和ER-phagy信号（RFP+GFP-）。同时，这些RFP+GFP-信号表现出明显的与溶酶体的共定位，进一步验证了该探针小鼠对ER-phagy信号的有效标记。通过对不同组织器官进行系统分析，发现组织内部及不同组织间存在ER-phagy水平的异质性。在动物发育过程中，内质网的周转率及其结构变化尚未被充分阐明。为了深入探究这一问题，研究人员系统分析了多种器官在不同发育阶段的ER-phagy动态。研究结果揭示，不同组织的内质网自噬在发育过程中呈现出显著的动态特征。随后，研究人员还探讨ER-TRG小鼠能否监测在不同生理和病理应激因素下体内ER-phagy的改变。研究发现，在饥饿反应下，肝脏，特别是中央静脉区域，表现出ER-phagy活性的显著增强。然而，饥饿处理未能引起骨骼肌的类似响应。在肝癌模型中，相对于癌旁组织或正常肝组织，肿瘤组织中的ER-phagy活性显著降低。在小鼠肌肉损伤再修复模型中，研究人员观察到，肌肉细胞在损伤后，ER-phagy活性降低，而新生肌原纤维中的ER-phagy活性部分恢复，但仍显著低于成熟肌原纤维。综上所述，这些研究结果证明不同组织中的ER-phagy对环境应激因素具有差异化的敏感性和响应模式。针对传统ER-TRG探针长期表达可能对细胞和小鼠健康造成潜在负担的问题，研究人员开发了一种新型遗传系统—CA-ER-TRG。CA-ER-TRG系统基于Cre-loxP重组技术，通过精心设计的遗传构建（CAG-loxP-Stop-loxP-ssRFP-GFP-KDEL），实现了ER及ER-phagy信号的可控、特异性标记。当与细胞类型特异性Cre（或CreER）小鼠或AAV-Cre病毒联合使用时，可精确标记目标细胞或组织。通过实验验证，研究人员发现：Rosa26-SA-CreERT2；CA-ER-TRG小鼠经短期Tamoxifen诱导，能有效标记多个组织的ER结构和ER-phagy信号；静脉注射特异性AAV-Cre同样可实现准确细胞标记。该工具不仅克服了传统探针的局限性，还为体内ER-phagy的细胞和组织特异性研究提供了可靠的技术平台。综上所述，该探针小鼠，能够在体内以单细胞分辨率进行ER-phagy和ER结构的精确时空测量，监测不同时空条件下ER-phagy活性的差异。这不仅加深了我们对ER-phagy在组织特异性和发育过程中作用的理解，也为未来针对特定组织和病理条件的靶向治疗策略的开发奠定了基础。浙江大学孙启明课题组博士后桑永娟博士和李博然博士为该论文第一作者。孙启明教授为该论文通讯作者。该研究得到浙江大学医学院刘伟教授、周以侹教授、王绪化教授、赵经纬教授和附属第二医院胡新央教授团队、及中国科学院生物物理所张宏教授等支持和帮助。原文链接：https://doi.org/10.1083/jcb.202408061
制版人：十一
1. Bravo R, Parra V, Gatica D, Rodriguez AE, Torrealba N, Paredes F, Wang ZV, Zorzano A, Hill JA, Jaimovich E et al (2013) Endoplasmic reticulum and the unfolded protein response: dynamics and metabolic integration. Int Rev Cell Mol Biol 301: 215-2902. Chino H, Mizushima N (2020) ER-Phagy: Quality Control and Turnover of Endoplasmic Reticulum. Trends Cell Biol 30: 384-3983. Dikic I (2018) Open questions: why should we care about ER-phagy and ER remodelling? BMC biology 16: 1314. Grumati P, Dikic I, Stolz A (2018) ER-phagy at a glance. Journal of cell science 1315. Molinari M (2021) ER-phagy responses in yeast, plants, and mammalian cells and their crosstalk with UPR and ERAD. Dev Cell 56: 949-9666. Schröder M (2008) Endoplasmic reticulum stress responses. Cell Mol Life Sci 65: 862-8947. Zhang H, Hu J (2016) Shaping the Endoplasmic Reticulum into a Social Network. Trends Cell Biol 26: 934-943BioART战略合作伙伴
（*排名不分先后）
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