必看！网药又现新搭档-谱效关系分析！浙江中医药大学接住了中医药的泼天富贵，现代分析联合传统中药，干湿结合登上1区Top！

学术 2024-11-01 10:00 上海

2024接近尾声，各位小伙伴近期的实验进展如何呀？如果仍有科研难题，欢迎call小云！今天咱们来看一篇中药网药的文章，这篇网络药理学结合了谱-效关系分析，新搭档咱们可不能错过哦～

这篇文章属于干湿结合类型，通过建立小鼠肝损伤模型，运用多种技术手段，比如GEO、网络富集分析、UPLC-Q-TOF-MS分析、GSEA分析、分子对接等，对传统中药进行了功能和机制研究。分析中用到的网络药理学和谱效关系分析，提高了识别中药中有效成分的精确性和可靠性。而且，作者最后还通过分子对接，预测了该中药的活性成分。

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题目：参芪丸可减轻对乙酰氨基酚所致的肝损伤：网络药理学和谱效关系综合策略揭示了其机制和活性成分

杂志：Phytomedicine

影响因子：IF=6.7

发表时间：2024年9月

关注公众号，后台发送“123”可以直接获取原文PDF，文献编号：241101

研究背景

对乙酰氨基酚(APAP)具有解热、镇痛等作用，服用过量可引起严重的药物性肝损伤(DILI)甚至急性肝脏毒性(ALF)。参芪丸(SQP)，是来自汉代医学文献“金匮要略”的古代中草药配方，现在也被称为桂附地黄丸，临床上可有效治疗各种肝病。但是，有助于SQP肝保护作用的具体机制和活性成分仍有待完全阐明。

研究思路

本文首先通过建立DILI模型，采集其血液和肝脏标本检测生化参数，验证SQP是否可减轻APAP诱导的肝损伤，然后利用UPLC-Q-TOF-MS分析确定SQP的体外和体内化学成分。

接着运用网络药理学探索了SQP在减轻肝损伤中的潜在机制并定量分析了SQP含药血清及活性，还利用谱-效关系分析鉴定了SQP中潜在活性成分。其中运用了KEGG途径富集分析、蛋白质印迹分析、免疫荧光反应等方法。

最后分析了SQP含药血清对APAP诱导的BRL-3A细胞线粒体损伤的影响及对AMPK通路对线粒体功能的影响，表明了SQP 是通过改善线粒体功能以减轻APAP诱导的肝损伤。然后使用了评分函数计算了其活性组分和AMPK的结合能，进而确定芍药苷和呋喃啉是否为AMPK的潜在变构激活剂。

主要结果

SQP可减轻APAP诱导的肝损伤

为了研究SQP是否对APAP诱导的肝损伤有效果。作者建立了DILI模型(图1A)，同时检测肝功能指标。数据表明，NAC和SQP (剂量为3g/kg和6g/kg)的14天方案显着改善了肝脏病理学，降低了肝脏指数(图1B-1C)，并降低了血清ALT和AST水平(图1D-1E)。此外，SQP治疗组显示肝脏抗氧化能力增强，表现为肝脏GSH减少和MDA水平升高(图1F-1G)。虽然APAP 治疗对脂质代谢也有破坏作用，但是用6g/kg的NAC和SQP处理可实现部分逆转(图1H)。此外，细胞因子分析显示，与APAP组相比，NAC和SQP显著降低肝脏中IL-1β，IL-6，TNF-α和il-33的分泌(图1I)。由此证明SQP可以减轻APAP诱导的肝损伤。

图1. SQP对肝损伤、血脂和炎症的影响

SQP 的体外和体内化学成分分析

研究采用UPLC-Q-TOF-MS技术分析其50%乙醇提取物的化学成份，使用SCIEX OS软件，鉴定了97种化合物(图2A)，其中有10个主要成分(图2B)。使用UPLC-Q-TOF-MS分析验证了大鼠血清中的SQP成分(图2C-D)。

图2. SQP化学成分的鉴定

网络药理学阐明SQP减轻APAP诱导的肝损伤的潜在机制

为了研究SQP在减轻肝损伤中的潜在机制，作者采用网络药理学确定了374个潜在靶点(图3A-B)，KEGG途径富集分析表明这些靶点主要参与细胞色素p450代谢和炎症(图3C)，由线粒体功能障碍引起的APAP诱导的肝损伤通过将线粒体功能障碍基因与374个潜在靶点重叠进一步分析，分离14个核心组分(图3D-E)。此外，GSEA显示在APAP处理的小鼠中AMPK信号传导途径的显著抑制，影响脂质代谢和脂肪酸β-氧化(图3F-H)。热图显示，在APAP处理的小鼠、HepaRG细胞和3D - MTS中，PRKAA1、PRKAB2、ACACB和ACADM mRNA表达水平降低，表明SQP通过AMPK途径对APAP诱导的肝毒性具有潜在的保护作用(图3I)。

图3. SQP减轻APPA诱导的肝损伤的网络药理学研究

SQP激活AMPK并上调cpt1和ACADM的表达

为了评估小鼠肝脏中AMPK信号传导途径和β-氧化的活性，检测 AMPK和乙酰辅酶a羧化酶(ACC)的磷酸化状态以及肉碱棕榈酰转移酶1(CPT1)和ACADM的表达水平。蛋白质印迹分析显示，与APAP组相比，SQP 处理显著激活AMPK，导致ACC磷酸化增加，cpt1和ACADM蛋白表达增加(图4A)。免疫荧光证实，SQP处理的受损肝细胞中p-AMPK和ACADM的荧光强度降低(图4B)。结果证明了，SQP调节 AMPK-ACC-CPT1-ACADM轴，增强脂肪酸代谢，支持肝脏修复。

图4. SQP激活AMPK并上调cpt1和ACADM的表达

SQP含药血清的定量分析和活性评价

为了模拟SQP的体内动力学，采用MRM模式下的UPLC-Q-TOF-MS分析血清中19种成分的峰面积(图5A)，APAP创建大鼠肝细胞损伤模型24小时(图1A)，然后用SQP再处理BRL-3A细胞24小时，测定结果表明 SQP剂量依赖性地增强线粒体呼吸(图5B)。并且用h-60和h-90处理显示出最显着的效果，显着增强各种呼吸参数(图5C-D)。

图5. SQP含药血清的定量分析和活性评价

通过光谱效应关系分析鉴定SQP中潜在的活性成分

使用来自SQP的19种血清组分的峰面积作为自变量x建立 PCA-X 模型(图6A)，使用10%血清浓度的BRL-3A细胞的5个线粒体呼吸参数作为因变量y建立 PCA-Y模型(图6B)，此外，建立了OPLS模型进行回归系数分析(图6E-F)，综合结果表明，肉桂醛、芍药苷、新碱、邻甲氧基肉桂醛、丹皮酚、呋喃啉、香豆素和苯甲酰次亚铁氨酸等化合物是SQP中潜在的活性成分，可以促进暴露于APAP的BRL-3A细胞线粒体能量代谢。

图6. 通过光谱-效应关系分析SQP含药血清中潜在的有效成分

SQP含药血清减轻APAP诱导的BRL-3A细胞线粒体损伤

为了研究SQP对线粒体损伤的影响，在APAP刺激后，与NRS组相比，SQP含药血清显著增强细胞增殖、形态、线粒体结构和降低ROS水平(图7A-7D)，与NRS组相比，SQP处理显着降低MPTP开放(图7E-7F)，与NRS培养相比，导致红/绿荧光强度比显著增加(图7G-7H)。总体而言，虽然富含营养素的NRS治疗在一定程度上减轻了APAP诱导的线粒体损伤，但AQP治疗的血清能更有效地恢复正常的线粒体功能。

图7. SQP含药血清减轻APPA诱导的BRL-3A细胞线粒体损伤

SQP通过激活AMPK通路减轻线粒体功能障碍

为了探讨SQP缓解线粒体功能障碍的分子机制，本研究在体外研究了其对AMPK及相关蛋白的影响，结果表明SQP显著恢复了ACC和 AMPK的磷酸化比率，并增加了CPT1和ACADM的表达，表明通过AMPK-ACC-CPT1-ACADM途径减轻了线粒体损伤(图8A)。图8B说明了SQP增强了线粒体能量代谢，提供肝保护作用。

图8. SQP药物血清对体外AMPK及其下游蛋白的影响

芍药苷、呋喃西林与AMPK蛋白的对接

使用Schroodinger软件将小分子与AMPK (PDB: 5ufu)对接，使用评分函数计算8种活性组分和AMPK变构激动剂pf-06409577的结合能。结果表明芍药苷和呋喃啉的结合能最低(图10A-10D)。另外，叠加显示呋喃啉和芍药苷的核心骨架与pf-06409577的核心骨架重叠，表明AMPK结合位点相似(图10E-10G)。利用western blot进一步分析AMPK的磷酸化水平，对比分析显示呋喃啉更能显著提高p-AMPK/AMPK比值(图10H）。这些结果表明，芍药苷和呋喃啉可能是AMPK的潜在变构激活剂。

图10. 呋喃啉和芍药苷与AMPK蛋白的对接

文章小结

这篇文章通过结合现代分析技术和网络药理学方法，对传统中药的活性成分和作用机制进行了深入研究，展现了在中药现代化研究中的创新性。小伙伴们看到这里是否对网络药理学有了新的想法？小云觉得传统中医药仍有许多创新思路可挖掘，需要专业的科研定制服务记得找小云哟~

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