Nat Commun到底有谁在啊，单细胞文章全过去了！中国医学科学院团队：scRNA-seq联合单细胞T细胞受体测序再创佳绩！

学术 2024-11-23 10:02 上海

号外，号外……豪门“水刊”NC单细胞测序近期又上新了，文章来自中国医学科学院高树庚/薛丽燕团队：

1.该研究采用单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单细胞T细胞受体测序（scTCR-seq）技术，深入分析了食管鳞状细胞癌（ESCC）患者在接受新辅助免疫化疗（nICT）治疗前后的肿瘤微环境。

2. 研究发现CXCL13+CD8+ Tex细胞在治疗前的肿瘤中高度浸润，并且在治疗后表现出明显的前体耗竭表型，揭示了特定免疫细胞亚群与治疗反应之间的关联。

3. 研究还是识别了与治疗抵抗相关的关键标志物（LRRC15+成纤维细胞和SPP1+巨噬细胞），为理解肿瘤微环境中免疫逃逸机制提供了新的见解。

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题目：单细胞测序揭示食管鳞状细胞癌新辅助免疫化疗治疗反应的免疫特征

杂志：Nat Commun

发表时间：2024.10

研究背景

新辅助免疫化疗（nICT）极大地改变了可手术食管鳞状细胞癌（ESCC）的治疗前景，但影响肿瘤对nICT反应的因素尚不清楚。该研究使用单细胞RNA测序（scRNA-seq）与T细胞受体测序（scTCR-seq）配对，分析了接受nICT治疗的ESCC患者的组织，并表征了肿瘤微环境背景。

研究思路

研究结果

在nICT治疗前后，局部晚期ESCC的TME以复杂和异质性细胞群为特征

为了描述ESCC对nICT治疗反应不同的TME特征，使用scRNA-seq和scTCR-seq分析了18例接受nICT治疗的ESCC患者的治疗前活检和治疗后手术样本共7例。分别从内镜活检和手术切除中获得治疗前和治疗后的样本，5例患者成功匹配。接受nICT治疗的ESCC患者分为反应者和无反应者，反应者定义为病理完全缓解或主要病理缓解。

scRNA-seq获得了128,600个优质细胞，根据相应的标记基因将其分为8大类细胞。根据典型标记基因的表达，每种细胞类型进一步聚类为多个亚群。结果显示，共鉴定出11个T细胞簇、6个B细胞簇、12个成纤维细胞簇、10个骨髓细胞簇、6个内皮细胞簇和2个上皮细胞簇。这些结果揭示了处理前和处理后ESCC样品中TME的复杂和异质性细胞成分。

无应答者表现出高度升高的终末CD8+ Tex细胞浸润水平以及激活CD4+ Tregs细胞比例的增加

通过UMAP对T细胞的scRNA-seq数据进行进一步的无监督分析，发现了11个T细胞簇，包括CD8+ Tex-CXCL13、CD8+ Tex-STMN1、CD8+ Tem-GZMK、CD8+ Teff-FGFBP2、CD8+ Teff-TYROBP、CD8+ Tn-IL7R、CD8+ T- isg15、CD4+ Treg-TNFRSF4、CD4+ Tfh/Th1-CXCL13、CD4+ Tn-CCR7和CD4+ T- stmn1。通过UMAP可视化这些T细胞簇在疗效组和治疗时间点的分布。

接下来，探索了应答者和无应答者之间所有T细胞类型中细胞比例的差异。在治疗后组织中的CD8+ T细胞中，与应答者相比，CD8+ Tex-CXCL13和CD8+ Tex-STMN1细胞在无应答者中高度浸润。接下来，计算了CD8+ Tex细胞的祖细胞和终衰竭特征。研究结果显示，与无应答者相比，应答者的CD8+ Tex-CXCL13和CD8+ Tex-STMN1细胞的祖细胞衰竭评分明显更高，但终端衰竭评分较低。对于治疗后无反应的CD4+ T细胞，发现CD4+ Treg-TNFRSF4细胞比例高度增加，CD4+ Tn-CCR7细胞浸润水平明显下降。基于独立回顾性nICT-ESCC队列的54例患者的RNA-seq数据，使用ssGSEA算法，验证了治疗后无应答者中CD8+ Tex-CXCL13、CD4+ Treg-TNFRSF4和CD8+ Tex-STMN1浸润水平升高。

CD8+ Tex-CXCL13细胞与ESCC免疫治疗的临床疗效密切相关

与无应答者相比，应答者在治疗前肿瘤中CD8+ Tex-CXCL13细胞的浸润评分明显更高。在96例接受nICT治疗的ESCC患者的治疗前样本中进行了CXCL13和CD8的多重免疫荧光检测。观察到应答者与无应答者相比，CXCL13/CD8双阳性细胞丰度显著更高。随后基于54例治疗前ESCC患者转录组谱的ROC分析显示，在预测CD274表达和CD8+ Tex-CXCL13浸润之间的治疗反应方面，c-指数相似，证实了CD8+ Tex-CXCL13细胞对ESCC免疫治疗的价值。

考虑到三级淋巴结构（TLSs）在抗肿瘤免疫中的关键作用，作者接下来检测了96个治疗后FFPE ESCC样本中TLSs的丰度。结果发现，TLSs在应答者治疗后的肿瘤组织中更为频繁，验证了TLSs在ESCC nICT过程中的有利作用。值得注意的是，处理后TLSs的丰度与处理前CD8+ Tex-CXCL13细胞比例呈统计学正相关。这些结果提示CD8+ Tex-CXCL13细胞可能通过募集TLSs增强nICT在ESCC中的疗效。

CXCL13增强体内抗PD-1治疗的疗效

由于CXCL13与ESCC免疫治疗的疗效增强相关，作者继续探索CXCL13对体内对检查点抑制剂反应的影响。用CXCL13和抗PD-1联合治疗皮下ESCC小鼠可显著抑制肿瘤生长。8次注射后，联合治疗组肿瘤体积和重量明显低于单药治疗组。此外，通过流式细胞术分析来评估不同组肿瘤中B细胞和CD8+ T细胞的比例。联合治疗组TME中CD20+细胞、CD8+细胞和PD-1+细胞的百分比明显高于对照组。肿瘤组织H & E染色显示，联合治疗组的病理反应率更高，证实了联合治疗策略的抗肿瘤效果更佳。此外，肿瘤组织CD4和CD8的多重免疫荧光检测证实了联合治疗组TME中浸润性免疫细胞的存在增加。这些结果表明CXCL13可能通过促进更活跃的TME来增强抗pd -1方案的疗效。

无应答者的特点是CD4+ Tregs细胞克隆扩增率显著升高，CD8+ Teff细胞克隆扩增率显著降低

为了描述T细胞特征与nICT治疗反应之间的关系，接下来通过scTCR-seq分析研究了免疫治疗期间不同时间点和不同疗效组之间克隆性的变化。将CD8+ Tex-CXCL13细胞定义为末端CD8+ Tex。UMAP图显示了不同患者、治疗时间点、克隆型和克隆大小的TCR数据的T细胞。在免疫化疗期间检测了ESCC中不同T细胞亚型的克隆扩增模式，观察到较高比例的高扩增克隆（n≥3个细胞）主要在CD8+ Tex和Teff细胞中。这表明CD8+ Tex和Teff细胞作为肿瘤抗原特异性CD8+ T细胞的关键作用。

与应答者相比，无应答者显示出更高的CD4+ Tregs克隆扩增和更低的CD8+ Teff细胞克隆扩增，表明CD4+ Tregs耐受性的增加和CD8+ Teff细胞对肿瘤抗原的识别不足可能有助于对nICT治疗的抵抗。治疗后无应答者CD4+ treg克隆扩增的基尼指数也明显高于应答者，这与无应答者CD4+ treg高度激活的发现一致。对于应答者，治疗后样本中CD4+ Tregs的克隆扩增明显低于治疗前组织。此外，为了追踪T细胞表型之间的谱系转换，作者测量了每个主要表型中与次级表型共享的克隆型的比例。观察到CD8+ T细胞簇之间存在显著的克隆型重叠，并且在治疗后应答者中表型转换更为活跃。

作者选择了所有与CD8+ Tex-CXCL13共享TCRs的CD8+ T细胞，并将这些T细胞称为Tex相关细胞。在与Tex相关的细胞中，未包含在CD8+ Tex- CXCL13细胞（末端Tex）中的细胞被命名为前体耗尽T细胞（Texp）。对Tex相关细胞的RNA速度分析揭示了从Texp到末端Tex的潜在过渡途径。结果还显示，在预处理无应答的样本中，Texp细胞的比例低于应答者。有趣的是，在nICT治疗期间，这一比例随着应答者终末Tex的增加而下降。这些结果表明，持续高水平的Texp浸润可能是提高ESCC患者免疫治疗效果的关键。

治疗后无应答者tCAF-MMP11显著富集

越来越多的证据表明，癌症相关成纤维细胞（CAFs）在TME重塑和对癌症免疫治疗的反应中起关键作用。作者基于scRNA-seq数据研究了不同治疗反应背后的CAFs分布。使用先前报道的标记基因，将CAFs注释到12个细胞簇中，其中iCAF-CFD， iCAF-CXCL12和iCAF-PLA2G2A在应答者的治疗后样本中被发现高度富集，而tCAF-MMP11被证明在无应答者中显著增加。

CAFs已被证明与Tregs的免疫抑制功能状态密切相关。作者研究了这两个集群之间的关系。值得注意的是，tCAFs的细胞比例与Tregs的细胞比例呈统计学正相关。关注配体-受体对，在无应答者中，tCAF-MMP11产生LGALS9作为特异性配体，具有丰富的调节潜力，通过CD44诱导CD4+ Treg-TNFRSF4的免疫抑制功能。该研究中，tCAF-MMP11被证明比其他CAF簇高表达LGALS9，并且LGALS9在治疗后无应答者中的表达水平明显高于应答者。

作者还发现LRRC15分子是tCAF-MMP11的特异性标记物，在tCAF-MMP11中，特别是在无应答者中高表达。治疗后无应答者中，tCAF-MMP11的激活状态更为明显，FAP、MMP11和PDPN的表达水平升高。基于独立ESCC队列的RNA-seq数据，进一步证实了scRNA-seq分析的结果，并揭示了nICT治疗期间LRRC15表达和tCAF-MMP11浸润的相似动态。与治疗前组织相比，治疗后应答者的LRRC15表达下降，但无应答者的LRRC15表达无显著变化。通过对tCAFs （α-SMA+LRRC15+细胞）和CD4+ treg （CD4+FOXP3+细胞）标记物进行多重免疫荧光分析，我们证实了这种空间分布上的相关性。同样，与应答者相比，观察到无应答者治疗后肿瘤中LRRC15+ CAFs和CD4+FOXP3+细胞同时富集。然而，两个疗效组之间CD4+和CD4+FOXP3+细胞浸润水平无显著差异，说明LRRC15+ CAFs选择性募集CD4+FOXP3+细胞，在无应答者中形成免疫抑制环境。综上所述， tCAF-MMP11的高浸润与CD4+ Treg-TNFRSF4细胞的激活和富集密切相关，从而限制了nICT治疗ESCC患者的疗效。LGALS9-CD44驱动的tCAF-MMP11与CD4+ Treg-TNFRSF4细胞的相互作用网络可能是提高ESCC免疫治疗疗效的潜在靶点。

SPP1+巨噬细胞和高表达SPP1的肿瘤细胞是ESCC治疗后免疫治疗耐药的标志物

巨噬细胞是TME的一个关键组成部分，实体肿瘤中巨噬细胞的表型多样性需要对不同的亚群进行全面的探索。通过scRNA-seq数据鉴定出8个巨噬细胞亚群，与接受nICT治疗的ESCC患者相比，在治疗后无反应者中观察到Macro-SPP1、Macro-EREG和Macro-STMN1显著富集。细胞-细胞相互作用分析显示，在治疗后应答者和无应答者中，Macro-SPP1和各种T细胞簇之间存在不同的通信网络。

在无应答者中，CCL20被证明是一种潜在的特异性配体，介导Macro-SPP1与CD4+ T细胞，特别是CD4+ Treg-TNFRSF4的细胞间相互作用，CCR6作为靶受体。此外，在无应答者中，与细胞毒性T淋巴细胞（CTL）损伤相关的配体-受体对（SPP1-CD44）是从Macro-SPP1到各种T细胞簇的特异性通信途径。在治疗后样本中，Macro-SPP1的细胞比例似乎与CD4+ Treg-TNFRSF4呈正相关。通过比较两组疗效组间Macro-SPP1的ssGSEA评分，也观察到类似的差异，在nICT治疗期间，应答者体内Macro-SPP1的浸润水平显著下降，治疗后仍明显低于无应答者。值得注意的是，在治疗后的ESCC样本中发现了Macro-SPP1和CD4+ Treg-TNFRSF4之间的显著正相关，而在治疗前的样本中则没有，这表明这两个簇之间的相互作用可能是由免疫化疗诱导的。这些发现表明，Macro-SPP1可能是ESCC免疫治疗耐药的关键标志物，它可能通过细胞间相互作用激活Tregs并抑制CTL。

文章小结

综上所述，本研究采用scRNA-seq和scTCR-seq相结合的方法，全面表征局部晚期ESCC对nICT治疗反应的免疫景观。该研究结果揭示了ESCC在免疫治疗过程中的细胞动力学和分子特征，并强调了CXCL13作为佐剂的潜力，以获得更好的免疫治疗效果。研究还发现LRRC15+ CAFs和SPP1+巨噬细胞的富集是免疫治疗耐药的关键标志物。

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