引用本文
刘 畅，陈 艳，李大鹏，等. 非定点方法构建的靶向CLDN18.2探针68Ga-NOTA-376的体内外性质评价［J］. 肿瘤影像学, 2024, 33 (4): 355-361.
基金项目：首都卫生发展科研专项（2022-2Z-2154，2022-2Z-2155）
通信作者：朱 华 E-mail:zhuhuaBCH@pku.edu.cn
通信作者简介
朱 华，研究员，博士研究生导师，北京大学肿瘤医院影像教研室副主任。受国家级青年人才计划支持，中国核学会放射性药物分会秘书长，曾获市 “百千万”、市“高创计划”青年拔尖、市“科技新星”称号。Journal of Pharmaceutical Analysis，Chemical & Biomedical Imaging，EJNMMI RPC， Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals等期刊编委。主持国家自然科学基金重点项目1项，面上项目2项，以及北京自然科学基金、首都卫生发展科研专项、科委交叉项目等多项；主持500余万元的企业横向课题。近5年以第一及通信作者在SCI收录期刊上发表论文60余篇。获授权专利12项（PCT 4项），依托NMPA放射性药物重点实验室，牵头30余种核素探针临床转化研究（12项NCT临床注册），以主要参与者进行核素探针转让（专利权）4项。获华夏医学科技奖三等奖（排名第二）。
非定点方法构建的靶向CLDN18.2探针68Ga-NOTA-376的体内外性质评价
刘 畅1，2，陈 艳3，李大鹏4，杨 志2，朱 华2
1.北京大学医学部医学技术研究院，北京 100191 ；
2.北京大学肿瘤医院暨北京市肿瘤防治研究所核医学科，消化系肿瘤整合防治全国重点实验室， 国家药品监督管理局放射性药物研究与评价重点实验室，恶性肿瘤发病机制及转化研究教育部重点实验室，北京 100142 ；
3.北京工业大学材料科学与工程学院，北京 100124 ；
4.贵州大学医学院，贵州 贵阳 550025
［摘要］ 目的：以非定点标记的方法构建68Ga标记的靶向CLDN18.2的正电子发射体层成像（positron emission tomography，PET）探针68Ga-NOTA-376，并评价其体内外性质。方法：以p-SCN-Bn-NOTA为螯合剂，非定点偶联靶向CLDN18.2的纳米抗体376，得到前体NOTA-376，对偶联后的前体进行68Ga放射性标记。通过放射性薄层色谱法（Radio thin layer chromatography，Raio-TLC）测定探针的标记率、放射化学纯度及体外稳定性，并进行探针在人胃腺癌小鼠模型的micro-PET/计算机体层成像（computed tomography，CT）显像实验。结果：68Ga-NOTA-376显示出高标记率（89.98±0.07）%、高放射化学纯度（97.67±0.02）%以及较高的比活度（16.69±6.60）GBq/μmol，并且在5%人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）和磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered saline，PBS）中保持稳定。Micro-PET/CT结果表明探针在CLDN18.2阳性肿瘤中的最大标准摄取值（maximum standard uptake value，SUVmax）显著高于CLDN18.2阴性肿瘤，4.0 h时CLDN18.2阳性肿瘤及CLDN18.2阴性肿瘤的SUVmax分别为9.08±0.33及1.92±0.32。结论：本研究以非定点标记的方法成功构建了靶向CLDN18.2探针68Ga-NOTA-376，标记率高，具有良好的稳定性及靶向性，是一种有潜力的PET探针，可用于CLDN18.2蛋白表达水平的检测。
［关键词］ 胃癌；正电子发射体层成像；68Ga；紧密连接蛋白18.2；非定点标记；纳米抗体
［Abstract］ Objective: To construct a positron emission tomography (PET) probe, 68Ga-NOTA-376, targeting CLDN18.2 using a non-site-specific labeling method, and to evaluate its in vitro and in vivo properties. Methods: The chelating agent p-SCN-Bn-NOTA was used to non-site-specifically conjugate the nanobody 376 targeting CLDN18.2, resulting in the precursor NOTA-376, which was then radiolabeled with 68Ga. The labeling efficiency, radiochemical purity, and in vitro stability of the probe were determined by radio-thin layer chromatography (Radio-TLC), and micro-PET/ computed tomography (CT) imaging experiments were conducted in a nude mouse model of human gastric adenocarcinoma. Results: 68Ga-NOTA-376 demonstrated a high labeling yield (89.98±0.07) %, high radiochemical purity (97.67±0.02)% and high specific activity (16.69±6.60) GBq/μmol, and remained stable in 5% human serum albumin (HSA) and phosphate-buffered saline (PBS). Micro-PET/CT results indicated that the maximum standardized uptake value (SUVmax) of the probe in CLDN18.2-positive tumors was significantly higher than in CLDN18.2-negative tumors. At 4.0 h, the SUVmax of CLDN18.2-positive tumors and CLDN18.2-negative tumors were 9.08±0.33 and 1.92±0.32, respectively. Conclusion: This study successfully constructed a CLDN18.2-targeting probe 68Ga-NOTA-376 using a non-site-specific labeling method, which showed high labeling efficiency, good stability, and targeting capability, making it a potential PET probe for the detection of CLDN18.2 protein expression levels.
［Key words］ Gastric cancer; Positron emission tomography; 68Ga; Claudin 18.2; Non-site-specific labeling; Nanobody
胃癌是严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一，据估计每年新发患者超过100万例，是全球第五大常见的癌症和癌症相关死亡的第三大原因［1］。中国胃癌的情况尤为严峻，其发病率和死亡率均位居前列［2］。尽管近年来胃癌防治水平逐渐提高，但由于胃癌的早期临床症状隐匿，早期诊断率低，许多患者在确诊时已处于中晚期，导致其治疗效果不佳［3］，晚期胃癌患者的中位生存期多小于8个月［4］。常规化疗是治疗晚期胃癌的基石，然而其在治疗效果方面存在较大的局限性［5］。随着精准医疗的出现，靶向治疗成为胃癌治疗的热点，为中晚期胃癌患者带来了新的希望。曲妥珠单抗是目前首个获批用于人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）阳性晚期胃癌的靶向治疗药物。然而，只有20%的胃癌是HER2阳性的，并且耐药性的出现进一步降低了靶向治疗的效果。因此，寻找新的靶点用于胃癌的诊断和治疗已迫在眉睫。FAST研究［6］为胃癌带来了新的靶点CLDN18.2。
CLDN18是紧密连接蛋白（Claudin）的家族成员之一，在维持细胞极性、渗透压以及屏障功能等方面发挥着重要作用。CLDN18有两种亚型，在肺泡上皮中高度表达的CLDN18.1和在胃组织中表达的CLDN18.2［7］，CLDN18.2通常埋藏于正常胃黏膜上皮细胞，维持胃黏膜的屏障功能［8］，在正常组织中通常不能被抗体所接近，当紧密连接被破坏，肿瘤细胞表面的CLDN18.2表位暴露［9］，参与肿瘤细胞的增殖分化和迁移，在50%~80%的胃癌患者中表达［10］，因此CLDN18.2是胃癌治疗的潜在靶点。目前，靶向治疗抗体的开发是CLDN18.2阳性肿瘤患者临床治疗的关键。
免疫组织化学法是检测CLDN18.2蛋白表达的主要方法，然而，免疫组织化学法具有较大的局限性，它需要侵入性进行内镜活检或手术，并且采样的部位及数量有限，另外，由于肿瘤的异质性，CLDN18.2在患者体内的分布和表达水平的动态变化也无法得到真实的反映［11］。因此，迫切需要新的技术来整体地、动态地检测CLDN18.2的表达水平，核医学分子影像能够在体内实时无创地检测胃肠癌患者体内CLDN18.2的表达，为CLDN18.2的准确诊断和灵敏检测提供了有力的方法。此前的CLDN18.2正电子发射体层成像（positron emission tomography，PET）研究主要集中于长半衰期核素如89Zr、124I直接标记抗体［12-13］，然而由于累积剂量高，放射性核素标记的完整大抗体在临床中的应用受到限制。相较于完整抗体，纳米抗体是来源于骆驼的重链可变区的单域抗体（variable domain of heavy-chain antibody，VHH），是目前可以得到的具有完整功能、稳定、可结合抗原的最小抗体单元［14］，具有体积小、穿透力强、亲和力良好以及代谢速率快等优势，这些特性使得纳米抗体可以与短半衰期核素如68Ga、18F等偶联，在更短时间内进行成像，具有显著的优势。
最近，Qi等［15］制备了以靶向CLDN18.2的纳米抗体为载体的PET示踪剂68Ga-NC-BCH，并进行了首次人体研究，结果表明68Ga-NC-BCH的摄取与CLDN18.2的表达水平显著相关，68Ga-NC-BCH PET在选择CLDN18.2靶向治疗患者及监测患者治疗效果方面具有巨大潜力。Wang等［11］制备了68Ga标记的靶向CLDN18.2的纳米抗体PHG102，得到PET示踪剂［68Ga］Ga-PMD 22，并进行了临床前及临床评估，证明了该示踪剂具有检测胃肠道癌患者CLDN18.2表达状态的临床潜力。这些研究使用了定点标记的方法来制备PET示踪剂，需要首先对纳米抗体进行修饰，使探针的构建过程更为复杂。本文使用了非定点标记的方法，开发了靶向CLDN18.2的新型纳米抗体分子探针68Ga-NOTA-376，并评估其在临床前模型中的初步应用。
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材料和方法
1.1 仪器与试剂
采用平生医疗科技（昆山）有限公司的Super Nova小动物micro-PET/计算机体层成像（computed tomography，CT）机，德国Isotope Technologies Garching GmbH公司的68Ge/68Ga发生器，美国Bioscan公司的放射性薄层色谱扫描仪，美国BrukerDaltonics的基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱仪（MALDI-TOF-MS）。 pSCN-Bn-NOTA购自美国Macrocyclics公司，纳米抗体376购自中国成都阿帕克生物科技有限公司，放射性核素68Ga来源于北京大学肿瘤医院核医学科68Ge/68Ga发生器，RPMI-1640基础培养基购自英国Invitrogen公司，胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）及青霉素-链霉素双抗购自美国Gibco公司，浓盐酸（HCl）购自中国医药集团有限公司，磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered saline，PBS）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，5%人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）购自瑞士CSL Behring AG公司，PD-10柱购自美国GE Healthcare公司。
1.2 细胞和动物模型构建
人胃腺癌细胞（human gastric adenocarcinoma cell line，AGS）来源于北京大学肿瘤医院，通过用全长CLDN18.2转染获得AGSCLDN18.2细胞系［15］，使用含10%FBS、1%青霉素和链霉素的RPMI-1640培养基，在37℃、CO2体积分数为5%的潮湿环境下培养。4周龄雌性BABLC/c裸小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。所有动物实验均按照北京大学机构动物管理和使用委员会（批准号EAEC2024-08）的指导原则进行。
1.3 双功能螯合剂偶联纳米抗体376
将分子螯合剂p-SCN-Bn-NOTA溶于二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶液中（10 mg/mL），与纳米抗体376按摩尔比10∶1混合，调节反应环境为pH 8.5，于37 ℃反应2 h。最后，在PBS中，通过分子排阻色谱法，采用PD-10柱从反应混合物中分离得到NOTA-376。通过MALDI-TOF-MS进行纳米抗体376及NOTA-376的质谱分析。
1.4 68Ga-NOTA-376的放射性标记
使用4 mL HCL（0.05 mol/L）淋洗68Ge/68Ga发生器，收集中间2 mL 68Ga淋洗液。取100 μL NOTA-376（1.4 mg/mL）与1 mL 125 MBq 68Ga淋洗液混合，加入65 μL 1 mol/L醋酸钠溶液，调节pH为4.5，37 ℃下反应15 min。达到反应时间后，停止加热，取样点板，用放射性薄层色谱仪分析标记率，展开剂为饱和乙二胺四乙酸/生理盐水（体积比1∶1）混合液。最后，通过凝胶过滤色谱法，采用PD-10柱纯化混合物，得到最终产品。
1.5 68Ga-NOTA-376的质量控制及体外稳定性
采用放射性薄层色谱法（radio-thin layer chromatography，Radio-TLC）分析68Ga-NOTA-376的放射化学纯度以及体外稳定性，展开剂为饱和乙二胺四乙酸/生理盐水（体积比1∶1）混合液。对于体外稳定性，取100 μL 68Ga-NOTA-376溶液，分别加入等体积的PBS及5%HSA，室温温育0.5 h、2.0 h、3.0 h，在每个时间点取样点板。
1.6 Ga-NOTA-376的micro-PET/CT显像
AGSCLDN18.2/AGS模型裸鼠尾静脉注射5.55 MBq 68Ga-NOTA-376，在注射后0.5、1.0、2.0、4.0 h，使用异氟烷气体麻醉荷瘤小鼠，进行静态PET扫描。经过平生医疗科技（昆山）有限公司的Avatar3重建后获得micro-PET/CT融合图像，勾画各个器官的感兴趣区（region of interest，ROI）计算最大标准摄取值（maximum standard uptake value，SUVmax）。
1.7 统计学处理
采用SPSS 25软件分析处理数据。符合正态分布的定量数据表示为x±s，所有误差条表示SD。使用Student t检验比较平均值，P＜0.05为差异有统计学意义。
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结 果
2.1 靶向CLDN18.2探针68Ga-NOTA-376的制备
68Ga-NOTA-376的非定点标记制备过程如图1所示。CLDN18.2纳米抗体376的理论相对分子质量为15 300，进一步精确其相对分子质量为15 459.941（图2）。将相对分子质量为448.492的双功能螯合剂p-SCN-Bn-NOTA连接到纳米抗体376上，MALDI-TOF-MS结果显示纳米抗体376大约1∶1螯合了NOTA螯合剂（图2）。偶联效率为（87.64±9.38）%（n=5）。
图1 68Ga-NOTA-376构建流程
图2 纳米抗体376相对分子质量及与NOTA偶联结果
2.2 68Ga-NOTA-376的质量控制及体外稳定性分析
经Radio-TLC检测，制备68Ga-NOTA-376的放射性标记产率为（89.98±0.07）%（n=6，表1），放射化学纯度为（97.67± 0.02）%（n=6）。图3是68Ga-NOTA-376的体外稳定性曲线，4.0 h内68Ga-NOTA-376在PBS及5%HSA中的稳定性分别保持在95%及90%以上。通过上述实验，证明68Ga-NOTA-376具有较高放射化学纯度及良好的体外稳定性，有利于后续的体内显像。质量控制及体外稳定性的结果也表明68Ga-NOTA-376的标记方法是可行的。
图3 68Ga-NOTA-37的标记率、放射化学纯度及稳定性
2.3 模型鼠micro-PET/CT显像
对右侧腋窝处携带AGS/AGSCLDN18.2肿瘤的BABLC/c裸鼠注射68Ga-NOTA-376后的0.5、1.0、2.0、4.0 h进行micro-PET/CT显像。
图像显示肾脏在68Ga-NOTA-376注射后的各个时间点具有很强的放射性，0.5、1.0、2.0、4.0 h各个时间点AGS模型鼠肾脏的SUVmax分别为12.69±0.29、12.33±0.07、47.22±0.99、49.48± 0.16，AGSCLDN18.2模型鼠肾脏的SUVmax分别为12.92±0.77、14.10±0.05、54.44±0.33、55.51±0.33（图4），表明68Ga-NOTA-376经过泌尿系统代谢。68Ga-NOTA-376在AGSCLDN18.2肿瘤部位快速积聚，0.5 h已可见肿瘤显像，SUVmax为2.02±0.19，2.0 h可观察到肿瘤高对比度成像，SUVmax为8.63±0.09，并随时间延长摄取逐渐升高，4.0 h时SUVmax为9.08±0.33（图4）。
在注射68Ga-NOTA-376后的各个时间点AGSCLDN18.2模型鼠肿瘤（T）与肌肉（M）的SUVmax之比均显著高于AGS模型鼠（P＜0.05，图5 ），并在注射后2.0 h达到最大值55.70±6.81。
图4 AGSCLDN18.2与AGS模型鼠micro-PET/CT图像及各器官SUVmax
图5 AGSCLDN18.2与AGS模型鼠各个时间点肿瘤（T）与肌肉（M）SUVmax比值
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讨 论
由于单克隆抗体的相对分子质量大，在体内代谢速度慢，需要匹配长半衰期核素，例如64Cu、89Zr等，导致临床患者的累积辐射剂量大、显像时间长、患者依从性下降等问题。纳米抗体是目前可结合抗原的最小抗体单元，具有亲和力高、血液清除快、稳定性高等理化性质，适合用于构建中短半衰期核素标记的放射性核素分子探针，能够更方便地用于肿瘤靶向治疗患者的筛选以及预后评估。
纳米抗体可以通过其侧链赖氨酸残基非特异性标记，利用螯合剂上的异硫氰酸苯甲酰基（pSCN）对赖氨酸残基进行氨基基团官能化［16］。本文首次使用非定点标记的方法成功构建了以纳米抗体为载体的靶向CLDN18.2的放射性分子探针68Ga-NOTA-376，与Qi等［15］使用定点标记的方法制备的68Ga-NC-BCH相比，该探针具有同样良好的标记率（89.98±0.07）%、放射化学纯度（97.67±0.02）%、体外稳定性、靶向性及亲和力，并且具有更高的肿瘤/肌肉比值（T/M）。本研究结果显示68Ga-NOTA-376的标记结果是可行的，该标记方法重现性好，与定点标记的方法相比，无需对抗体进一步修饰，具有更加高效、便捷的优势。
CLDN18.2高表达的AGS细胞系及野生型的AGS细胞系小鼠移植瘤模型micro-PET/CT结果显示，68Ga-NOTA-376在小鼠细胞及肿瘤中的摄取与CLDN18.2的表达高度相关，AGSCLDN18.2模型鼠的摄取值明显高于AGS模型鼠的摄取值。本课题组此前研究［15，17］中的免疫组织化学的结果显示，AGSCLDN18.2肿瘤中CLDN18.2高且均匀表达，而AGS肿瘤中CLDN18.2表达呈阴性。
综上所述，本文建立了标记率高、放射化学纯度高、稳定性可靠且靶向性好的CLDN18.2靶向的纳米抗体放射性探针的68Ga非定点标记方法，显示出进一步应用于临床进行靶向治疗患者筛选及治疗效果评估的潜力。
［参考文献］
编辑：徐虹
审核：倪明
