引用本文
段小江，张卓晨，傅子鉴，等. 以SCN-Bn-DOTA为螯合基团的PSMA靶向探针68Ga-P214的制备与临床前评估［J］. 肿瘤影像学, 2024, 33 (4): 362-368.
基金项目：国家自然科学基金（22106006）；北京大学第一医院科研“希望之星”专项（2023XW）；中央高水平医院临床科研业务费资助（北京大学第一医院院内交叉研究专项:2024IR04）
通信作者：杨 兴 E-mail: yangxing2017@bjmu.edu.cn
通信作者简介
杨 兴，研究员，博士研究生导师，北京大学第一医院科研处副处长兼实验中心主任，核医学科副主任，长江学者，中共中央组织部青年海外高层次人才。围绕泌尿系统肿瘤，从事分子影像药物化学及临床转化方向研究，以第一作者或通信作者在SCI收录期刊上发表学术论文70余篇，实现全新放射性药物临床转化研究4项，完成签约价值2 000万元的发明专利技术转让1项。
以SCN-Bn-DOTA为螯合基团的PSMA靶向探针68Ga-P214的制备与临床前评估
段小江，张卓晨，傅子鉴，潘星灿，杨 兴
北京大学第一医院核医学科，北京 100034
［摘要］ 目的：适当延长三七素类前列腺特异性膜抗原（prostate specific membrane antigen，PSMA）靶向探针的体内循环时间，开发新型68Ga标记的前列腺癌诊断探针。方法：采用固相合成法制备配体P214（以p-SCN-Bn-DOTA为双功能螯合基团），测定其亲和性。将配体加入到含68Ga3+离子的缓冲液中，95 ℃下反应5 min，纯化后使用放射性薄层色谱法测定其放射化学纯度。评估68Ga-P214的体外稳定性、脂水分配系数和人血清白蛋白结合率，并进行细胞摄取实验。对荷22Rv1瘤小鼠注射68Ga-P214，特定时间进行micro-正电子发射体层成像（positron emission tomography，PET）/计算机体层成像（computed tomography，CT）显像，并与68Ga-P137进行对比显像。尾静脉注射探针30、60和120 min后，处死实验鼠，取感兴趣器官称重、计数、计算每克组织注射剂量活度百分比（%ID/g）。结果：成功合成目标配体P214，其Ki值为0.085 nmol/L，标记产物68Ga-P214放射化学纯度大于95%，在生理盐水和37 ℃小鼠血清中2 h保持稳定。68Ga-P214的脂水分配系数为-3.17±0.09，对人血清白蛋白的结合率为（88.86±0.51）%，明显高于68Ga-P137的（74.01±1.17）%。细胞实验发现68Ga-P214能够有效被PSMA+细胞22Rv1摄取，温育30、60和120 min后，细胞摄取分别为（0.39±0.14）、（0.55±0.09）、（0.54±0.12）%ID/105细胞，且可被PSMA抑制剂ZJ43所抑制。注射后60 min，68Ga-P214在肿瘤区域内有更高的最大标准摄取值（maximum standard uptake value，SUVmax）（1.40±0.11 vs 0.80±0.04），且随时间而增加。荷瘤小鼠生物分布表明，68Ga-P214在肿瘤的摄取明显高于68Ga-P137［（44.15±6.25）%ID/g vs（19.76±3.56）%ID/g，注射后120 min］，68Ga-P214拥有优异的肿瘤/肌肉、肿瘤/血液和肿瘤/肝脏的比值（127.63、33.87和12.68）。结论：68Ga-P214生物分布理想，适当延长了三七素类探针的在体循环时间，在PSMA阳性肿瘤中的摄取显著增加，有望应用于前列腺癌的诊断，有较大的潜力改造为治疗探针。
［关键词］ 前列腺癌；前列腺特异性膜抗原；三七素；镓-68；放射性药物
［Abstract］ Objective: To appropriately extend the in vivo circulation time of ginsenoside-like prostate-specific membrane antigen (PSMA) targeting probes and develop a novel 68Ga-labeled diagnostic probe for prostate cancer. Methods: The ligand P214 (using p-SCN-Bn-DOTA as a bifunctional chelator) was synthesized using solid-phase synthesis, and its affinity was measured. The ligand was added to a buffer containing 68Ga3+ ions, reacted at 95 ℃ for 5 min, and then purified. The radiochemical purity was determined using radioactive thin-layer chromatography. The in vitro stability, lipophilicity and human serum protein binding rate of 68Ga-P214 were evaluated, followed by cell uptake experiments. 68Ga-P214 was injected into 22Rv1 tumor-bearing mice, and micro-positron emission tomography (PET)/computed tomography (CT) imaging was performed at specific time points, with comparative imaging using 68Ga-P137. Mice were sacrificed at 30, 60 and 120 min post-injection via tail vein, and organs of interest were weighed, counted, and the percentage of injected dose per gram of tissue (%ID/g) was calculated. Results: The target ligand P214 was successfully synthesized with a Ki value of 0.085 nmol/L, and the radiochemical purity exceeded 95%. The labeled product 68Ga-P214 remained stable in saline and 37 ℃ mouse serum for 2 h. The lipophilicity (partition coefficient) of 68Ga-P214 was -3.17±0.09, and the human serum albumin binding rate was (88.86±0.51)%, significantly higher than that of 68Ga-P137 (74.01±1.17)%. Cell experiments demonstrated that 68Ga-P214 was effectively taken up by PSMA+cells (22Rv1), with uptake rates of (0.39±0.14), (0.55±0.09), and (0.54±0.12) %ID/105 cells at 30, 60, and 120 min of incubation, respectively, which could be inhibited by the PSMA inhibitor ZJ43. At 60 min post-injection, 68Ga-P214 had a higher maximum standard uptake value (SUVmax) in the tumor region (1.40±0.11 vs 0.80±0.04), which increased over time. Biodistribution in tumor-bearing mice showed that 68Ga-P214 had significantly higher uptake in tumors compared to 68Ga-P137 ［(44.15±6.25)%ID/g vs (19.76±3.56)%ID/g at 120 min post-injection］, with superior tumor/muscle, tumor/blood, and tumor/liver ratios (127.63, 33.87, and 12.68, respectively). Conclusion: 68Ga-P214 exhibits ideal biodistribution, appropriately extends the in vivo circulation time of ginsenoside-like probes, and significantly increases uptake in PSMA-positive tumors, making it a promising candidate for prostate cancer diagnosis with considerable potential to be developed into a therapeutic probe.
［Key words］ Prostate cancer; Prostate-specific membrane antigen; Ginsenoside; Gallium-68; Radiopharmaceuticals
前列腺癌作为全球男性第二高发的恶性肿瘤，近年来在中国的发病率也呈快速上升的趋势［1-2］。前列腺特异性膜抗原（prostate specific membrane antigen，PSMA）在约90%的前列腺癌组织内过量表达，因此成为前列腺癌的重要靶点之一［3］。近些年，靶向PSMA的小分子药物迅速发展，多种探针已经在全世界范围内广泛开展临床研究，在前列腺癌的诊断分期、危险度分层、疗效监测等方面具有重要作用［4］。传统的PSMA靶向的探针多以谷氨酸-脲-赖氨酸为靶向结构，该类探针存在肾脏核素背景较高等问题。本课题组基于新型三七素-脲-赖氨酸靶向结构，通过对靶向结构和螯合剂之间的连接部分（linker）优化，成功开发了与68Ga-PSMA617相仿的三七素探针68Ga-P137［5-7］ 。177Lu-PSMA617作为一个小分子探针在肿瘤中的绝对摄取尚显不足，在多数前列腺癌患者体内会迅速排出体外，使得部分患者的前列腺特异性抗原（prostate-specific antigen，PSA）下降不明显［8］。白蛋白结合剂修饰的小分子可以延长血液循环半衰期，增加绝对肿瘤摄取，提高治疗效果［9］，但也会带来非特异性毒性，如增加血液系统毒性的可能。因此适当延长该类探针的血液循环时间，或可更好地平衡治疗效果与潜在不良反应的关系，为此本课题组尝试通过以SCN-Bn-DOTA取代P137结构中的DO3A（1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三乙酸），得到一种新型三七素类PSMA靶向配体P214，并将其进行68Ga标记，评估该探针的理化性质和体内外特性，以及对延长血液循环时间进行验证。
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材料和方法
1.1 实验材料与仪器
实验材料：乙腈（色谱纯）、三氟乙酸（分析纯）购自于北京伊诺凯科技有限公司；其他化学试剂购自上海毕得医药科技股份有限公司，均为分析纯；人前列腺癌细胞系22Rv1购自武汉普诺赛生命科技有限公司；DMEM培养基、胎牛血清、磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）均购自武汉普诺赛生命科技有限公司；0.25%胰蛋白酶消化液购自中科迈晨（北京）科技有限责任公司；PSMA重组蛋白购自北京义翘神州科技股份有限公司；薄层色谱纸iTLC-SG购自美国Agilent Technologies公司；BALB/c雄性裸小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2021-0006，均为4~6周龄，雄性，并于无特定病原体（specific pathogen free，SPF）环境中饲养。
实验仪器：68Ge-68Ga发生器购自德国ITG公司；放射性薄层色谱检测器购自美国Bioscan公司；Inliview 3000B小动物PET/SPECT/CT购自北京永新医疗设备有限公司；多探头全自动γ计数器购自德国Hidex公司。
1.2 实验方法
1.2.1 配体P214的合成
配体P214采用标准的Fmoc肽固相合成方法合成（图1），树脂13参考文献［6］得到。以树脂13为原料，依次偶联Fmoc保护的氨基酸，得到中间体14，使用三氟乙酸将中间体15从树脂上脱离下来，在碱性条件下和p-SCN-Bn-DOTA进行偶联，粗产物经高效液相层析纯化，冻干后得到白色粉末，产物P214经质谱确认。
图1 P214合成与68Ga标记
a：20%哌啶的DMF（N,N-二甲基甲酰胺）溶液，Fmoc-2-Nal-OH、HBTU（O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐）、HOBt（1-羟基苯并三唑）和DIPEA（N,N-二异丙基乙胺）的DMF溶液；b：20%哌啶的DMF溶液，Fmoc-4-Amb-OH、HBTU、HOBt和DIPEA的DMF溶液；c：三氟乙酸，水和三异丙基硅烷；d：p-SCN-Bn-DOTA，三乙胺，二甲基亚砜。
1.2.2 配体P214抑制常数Ki的测定
抑制常数Ki的测定方法参照参考文献进行。检测步骤：向板中加入PSMA重组蛋白（原始浓度为0.4 μg/mL）；将8个不同浓度的P214抑制剂依次加入重组蛋白溶液中；将NAAG分别加入到各个孔中，37 ℃下温育2 h；最后每孔加入邻苯二甲醛检测试剂，37 ℃下温育3 min（n=3）。利用GraphPad Prism分析数据得到半抑制常数IC50，根据Cheng-Prusoff方程计算抑制常数Ki。
1.2.3 配体P214和P137的放射性标记、质量控制
使用二甲基亚砜将1.5 mg配体P214稀释至10 μg/μL，吸取4 μL配体溶液和200 μL NaOAc溶液（1 mol/L）于西林瓶中，加入3 mL淋洗得到的68Ga3+离子溶液（溶剂为0.05 mol/L的HCl溶液，放射活度为684~740 MBq），摇匀后密封，95 °C下反应5 min（图1）。待反应液降至室温后，用注射器将液体加载到活化的Sep-Pak Light C18柱上，再用0.5 mL 80%乙醇淋洗Sep-Pak Light C18柱，使用生理盐水稀释得到最终产物。使用放射性薄层色谱进行放射性化学纯度的测定，展开剂为0.1 mol/L EDTA二钠盐溶液。
1.2.4 68Ga-P214体外稳定性和脂水分配系数（log P）测定
稳定性及脂水分配系数实验方法参照参考文献［6］进行。稳定性实验：将100 μL约18.5 MBq配合物加入到100 μL生理盐水中室温温育，或将 100 μL约18.5 MBq配合物加入到100 μL者小鼠血清中37 ℃温育。在30、60和120 min时，取样经放射性薄层色谱法测定其稳定性。log P实验：将500 μL用PBS稀释的配合物（约0.185 MBq）加入到500 μL正辛醇中。充分混合后，室温下涡旋2 min，然后3 000 r/min离心5 min，离心半径 1 cm。充分静置后，每层各取100 μL，用γ计数器测定放射性计数，重复3次。
1.2.5 人血清白蛋白结合实验
取5支1.5 mL离心管，每管加入0.1 mL人血清白蛋白（20%）和10 μL放射性探针（约0.37 MBq），摇匀后置于37 ℃温育60 min。温育结束后，加入三氯乙酸溶液（0.5 mg/mL）将蛋白沉淀，离心（5 000 r/min，5 min），取出上清液，再加1 mL生理盐水洗涤沉淀，再次离心，合并上清液，分别测定沉淀和上清液的放射性计数。人血清白蛋白结合率%=沉淀计数/（沉淀计数+上清液计数）×100。
1.2.6 细胞摄取实验
将每孔2×105个22Rv1细胞接种于24孔板中，温育48 h后使用。新鲜培养基洗两次，实验组每孔加入74 kBq 68Ga-P214或者68Ga-P137，37 ℃温育30、60和120 min（n=6）；抑制组在100 μmol/L PSMA抑制剂（ZJ-43）下进行温育（n=6）；温育完成后吸净培养基，用含0.2%牛血清白蛋白的冷PBS（0.5 mL）洗2次，最后实验组与抑制组用0.5 mol/L NaOH溶液温育10 min破碎细胞，收集溶液，用γ计数器分别计数。
1.2.7 荷瘤小鼠micro-正电子发射体层成像（positron emission tomography，PET）/计算机体层成像（computed tomography，CT）
在BALB/c雄性裸鼠皮下植入107个22Rv1细胞，当肿瘤直径达到6~8 mm时，进行荷瘤鼠成像研究。通过尾静脉对22Rv1荷瘤鼠注射68Ga-P214（约7.4 MBq，100 μL，n=4）。在注射 60和120 min后，将小鼠麻醉（2%异氟烷），进行micro-PET/CT静态成像，抑制组提前30 min注射ZJ-43（50 mg/kg）。对22Rv1荷瘤鼠注射68Ga-P137后进行60 min和120 min静态显像。通过校正，对图像进行迭代重建，并将其转换为标准摄取值（standard uptake value，SUV）图像。
1.2.8 荷瘤小鼠生物分布研究
通过尾静脉注射0.1 mL（0.74 MBq）68Ga-P214到22Rv1荷瘤小鼠体内。分别于注射后 30 min、1 h和2 h处死动物。对感兴趣的器官进行解剖、洗净和称重，使用γ计数器对器官进行放射性测量，并计算为每克组织注射剂量摄取百分比（%ID/g）。阻断实验在注射探针前30 min注射ZJ-43（50 mg/kg）。
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结 果
2.1 P214的制备、表征和P214抑制常数Ki结果
P214的化学合成收率为33%，质谱（理论值：1 230.4［M+H］+，实测值：1 230.9）与理论相符，高效液相层析检测化合物纯度大于95%。P214和P137的Ki值分别为0.085 nmol/L（95% CI 0.047~0.151 nmol/L）和0.118 nmol/L（95% CI 0.074~0.187 nmol/L），表明P214对PSMA蛋白具有良好的亲和力，对PSMA蛋白的亲和能力略高于P137。
2.2 68Ga-P214放射性标记、质量控制和体外稳定性测试
68Ga-P214通过95 ℃加热5 min，经纯化后其放射化学纯度可达99%。68Ga-P214在生理盐水和小鼠血清中2 h均保持稳定，可进行下一步实验。
2.3 68Ga-P214脂水分配系数和人血清白蛋白结合率
68Ga-P214 的脂水分配系数log P为-3.17±0.09，较68Ga-P137（log P：-3.33±0.04）亲水性略低（P=0.06），说明68Ga-P214具备延长代谢动力学的潜力。68Ga-P214和68Ga-P137对人血清白蛋白结合率分别为88.86%±0.51%和74.01%±1.17%（P＜0.01），表明68Ga-P214有更长血液循环时间的潜力。
2.4 68Ga-P214细胞摄取实验
温育30、60和120 min后，22Rv1细胞对68Ga-P214的摄取值分别为（0.39±0.14）、（0.55± 0.09）、（0.54± 0.12）%ID/105细胞，而22Rv1细胞对68Ga-P137的摄取值分别为（0.18±0.03）、（0.18±0.02）、（0.18±0.01）%ID/105细胞（均P＜0.01），加入抑制剂ZJ-43后，68Ga-P214在120 min的总摄取值明显降低［（0.07±0.01）%ID/105细胞，P＜0.01］，表明68Ga-P214在22Rv1细胞中拥有更高的摄取值，对于PSMA蛋白也具有特异性。在温育后60 min内，22Rv1细胞对68Ga-P214的摄取持续增加，而22Rv1细胞对68Ga-P137的摄取在 30 min后即达到饱和。
2.5 荷瘤小鼠micro-PET显像
注射60 min后，68Ga-P214在在肿瘤区域内有较高的放射性核素浓聚（SUVmax为1.40±0.11），该药物主要通过泌尿系统排泄，最终由膀胱排出，其他脏器未见明显核素聚集（图2）。68Ga-P214在肿瘤区域的摄取时间延长不断增加，注射120 min时，摄取的SUVmax增加到1.54±0.11。同时68Ga-P214在肿瘤区域的摄取可被ZJ-43明显抑制（SUVmax为0.61±0.06），说明68Ga-P214特异性靶向在PSMA阳性肿瘤区域。注射60和120 min后，68Ga-P214在肿瘤区域摄取值均高于68Ga-P137（注射后60 min：1.40±0.11 vs 0.80±0.04，P＜0.01；注射后120 min：1.54±0.17 vs 0.89±0.03，P＜0.01），表明68Ga-P214有效延长了在生物体内的代谢动力学过程。
图2 68Ga-P137和68Ga-P214的荷瘤鼠PET/CT图像（最大密度投影）
2.6 荷瘤鼠的生物分布
注射30、60和120 min后，放射性在肾脏的摄取值分别为（121.27±16.23）、（180.22±12.23）和（86.27±26.99）%ID/g，在120 min时达到最高，随后开始降低，说明68Ga-P214 主要经泌尿系统排泄。注射60 min内，68Ga-P214在肿瘤内的摄取持续增加，由（29.88± 12.26）%ID/g增加到（48.97±11.70）%ID/g，随后基本保持不变，在120 min时，其在肿瘤的摄取为（44.15±6.25）%ID/g。68Ga-P214在血液和肺等非靶器官的放射性清除较快，药物注射后120 min摄取明显减低，肿瘤与肌肉的比值由30 min时的15.90上升到120 min时的127.63，肿瘤与血液的比值则由30 min时的3.87上升到120 min 时的33.87。同时抑制剂ZJ-43能明显抑制肿瘤和肾脏对68Ga-P214的摄取［（44.15± 6.25） %ID/g和（ 86.27± 26.99）%ID/g分别降低到（2.31±0.53）%ID/g和（4.84±0.560）%ID/g，均P＜0.01］，而肿瘤与肌肉和肿瘤与血液的比值明显降低，证明了68Ga-P214对PSMA蛋白的特异性。注射120 min时，68Ga-P214在肿瘤的摄取明显高于68Ga-P137［（44.15±6.25）%ID/g vs （19.76±3.56）%ID/g，P＜0.01］，肿瘤与肌肉和肿瘤与血液的比值低于68Ga-P137（127.63 vs 439.4和33.87 vs 65.75），表明了68Ga-P214的体内循环时间长于68Ga-P137，而肿瘤与肝脏的比值要优于68Ga-P137（12.68 vs 2.18），表明68Ga-P214在体内的生物体内的稳定性优于68Ga-P137。
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讨 论
PSMA在前列腺癌及其转移灶中高表达，PSMA PET/CT在前列腺癌的诊断、分期、预后判断和治疗等方面具有重要作用［10-13］。本课题组开发以三七素-脲-赖氨酸为靶向结构的探针，即68Ga-P137，该探针的显像效果与肾脏背景较低的68Ga-PSMA617相当［6］，并验证了三七素类探针的临床潜力。Zhang等［14］的研究发现，PSMA蛋白的空腔中有一个全新的芳烃结合位点，可以提高抑制剂的亲和性。这个芳烃结合位点大约离催化口袋有10个原子的距离，为此我们使用SCN-Bn-DOTA代替了68Ga-P137结构中的DO3A螯合基团，SCN-Bn-DOTA中的芳香环恰好可以与PSMA蛋白中的芳香烃结合位点进行结合，或可提高其亲和性，同时适当增加新探针的脂溶性，延长探针在活体的血液循环时间。
配体P214易于合成，同时具有较高的化学产率和收率。配体P214对于PSMA蛋白具有良好的亲和力，略高于P137，达到0.085 nmol/L。68Ga标记的探针能够获得≥95%的放射化学纯度，并且具备良好的体外稳定性和高于68Ga-P137的脂溶性（LogP：-3.17±0.09 vs -3.33±0.04）。68Ga-P214人血清白蛋白结合率明显高于68Ga-P137（88.86%±0.51% vs 74.01%±1.17%），这可能是因为68Ga-P214具有更长的血液循环时间，生物分布中68Ga-P214血液摄取明显高于68Ga-P137也验证了这一点［（1.30±0.30）%ID/g vs （0.30±0.07）%ID/g，注射后120 min］。在细胞实验中68Ga-P214能够特异性与PSMA蛋白结合，证明了68Ga-P214在良好的体外特性，值得进一步研究。
Micro-PET/CT和生物分布都显示68Ga-P214主要经肾脏排泄，在血液和肺衰减较快，证实68Ga-P214探针能够特异性地浓集在PSMA阳性的肿瘤区域。移植瘤小鼠生物分布表明，68Ga-P214具有更加适宜的血液循环能力，在肿瘤中的摄取明显高于68Ga-P137［（44.15±6.25）%ID/g vs （19.76±3.56）%ID/g，注射后120 min］，也拥有优异的肿瘤/肌肉、肿瘤/血液和肿瘤/肝脏的比值（127.63、33.87和12.68）。68Ga-P214拥有更高的肿瘤/肝脏的比值，其可能原因是P214中螯合基团DOTA 4个羧基，对Ga离子的配体能力更强，对于治疗核素177Lu而言也是如此，DOTA和DO3A对镥离子的稳定常数分别是25.4和23.0，DOTA与镥形成的配合物更加稳定［15］。
综上，以SCN-Bn-DOTA为双功能螯合基团的三七素类探针68Ga-P214具备良好的体内、体外性质，更优异的血液循环时间和更高的肿瘤摄取，具有转化为177Lu核素治疗探针的潜力。
［参考文献］
编辑：徐虹
审核：倪明
