清华大学深圳国际研究生院Nature Communications｜单细胞蓝藻依赖于Na+，固定N2

转自：iSynFox

作者：Si Tang, Xueyu Cheng, Yaqing Liu, Lu Liu, Dai Liu, Qi Yan, Jianming Zhu, Jin Zhou, Yuyang Jiang, Katrin Hammerschmidt, Zhonghua Cai

接收时间：25 October 2024

https://doi.org/10.1038/s41467-024-53978-9

Nature Communications 影响因子：16.6

背景介绍

在生态系统中，蓝藻的固氮能力对沿海水域氮循环起着至关重要的作用。尽管如此，这些能在氮素稀缺环境中固氮的微生物，在沿海水域中的分布却异常稀少，形成了一个生态学上的谜题。此前，高盐度（>10 g/L）被认为可能是限制蓝藻固氮活性的主要因素。

近期的研究发现，一种单细胞沿海蓝藻的固氮活动完全依赖于钠离子（Na⁺），且在NaCl浓度低于4 g/L时，其固氮作用受到抑制。研究中的Cyanothece sp. ATCC 51142（现归类为Crocosphaera subtropica）在无Na⁺环境下，尽管其nifHDK基因表达上调且固氮酶合成量增加，但无法固定N₂，生长也停滞不前。进一步分析表明，这种固氮能力下降是由于ATP供应不足所导致。    

此外，该研究还发现，这种蓝藻的固氮过程并非依赖于常规的质子能量学和有氧呼吸，而是依赖于钠能量学和混合酸发酵，即便这些细胞是在有氧条件下培养的。这些发现为我们理解蓝藻在沿海环境中的能量代谢和生态策略提供了新的视角。未来的研究需要深入探讨这些机制的具体作用，并验证这些发现是否广泛适用于其他沿海蓝藻。

图文解读

图1 |NaCl对Cyanothece sp.在不同氮条件下生长的影响

本图展示了Cyanothece sp.在不同NaCl浓度下的生长情况。在氮充足条件下，细胞在不同培养基中的生长相似，而在氮缺乏条件下，仅在含有NaCl的人工海水培养基（ASP2-N）中观察到细胞生长，表明NaCl对N₂固定至关重要。图中数据揭示了NaCl浓度与N₂固定活性之间的直接关联，低NaCl浓度下N₂固定几乎被完全抑制，而在18 g/L NaCl时达到最大活性。

a 在四种不同培养基中细胞在9天内的生长曲线。

b 在BG11₀培养基中添加NaCl后，7天大的非生长细胞在7天内的生长曲线。

c 在含NaCl梯度的BG11中生长的细胞数量增加。

d 在含NaCl梯度的BG11₀中生长的细胞数量增加。

e 在含NaCl梯度的BG11₀中生长的细胞的N₂固定活性。固氮酶活性以乙炔还原产生的乙烯（C₂H₄）表示。数据以平均值 ± 标准差（n = 3个生物学独立样本）呈现。    

图2 | NaCl存在与缺失下转录组分析

通过比较NaCl存在与缺失条件下的转录组数据，发现在无NaCl条件下，与N₂固定相关的基因表达发生了显著变化。图中的热图显示了与核糖体生物合成和光合作用相关的基因在NaCl缺失条件下的下调表达，这与细胞在缺乏NaCl时无法生长和分裂的生理状态相一致。

a 热图分析显示了富集的核糖体生物合成相关的差异表达基因（DEGs）（map03010）以及 (b) 光合作用（map00195）。分析了两个核糖体蛋白组分（小亚基、大亚基）和六个光合亚基（光系统II（PSII）、细胞色素、光系统I（PSI）、ATP合酶、藻胆蛋白、藻蓝蛋白）。KEGG注释是从基因组注释中分配的。列树状图表示基于欧几里得距离和层次聚类的相似性。基因簇是通过欧几里得距离的k均值聚类确定的。热图颜色梯度显示低基因表达（蓝色）和高基因表达（红色）。    

c 固氮酶结构基因（nifHDK）的表达趋势。数据（TPM，每百万转录本数）以箱线图（下界在25百分位数，中心线在中位数，上界在75百分位数）呈现，须线在最小值和最大值处。阴影图表示基因表达水平的显著差异，箭头指示这两种处理之间统计显著趋势的方向（p < 0.05，右尾Fisher精确t检验后跟Benjamin-Hochberg (BH)调整）。选定基因的统计显著性是从三重复样本的TPM配对比较中计算得出的。“NaCl”表示在BG11₀中额外添加NaCl（18 g/L），而“None”表示在BG11₀中没有添加额外物质。源数据提供为源数据文件。

本图探讨了NaCl对N₂固定的特异性需求。实验显示，只有NaCl能够刺激细胞生长，而其他金属氯化物如KCl、LiCl、MgCl₂和CaCl₂均无法替代NaCl的作用。此外，图中还展示了Na⁺在氮素同化过程中的作用，以及Na⁺对氮素酶活性的影响。

a 在BG11₀培养基中添加五种不同金属氯化物：NaCl、KCl、LiCl、MgCl₂和CaCl₂后细胞数量的增加。

b 单细胞蓝藻N₂固定的途径示意图。在BioRender中创建。Tang, S. (2023) BioRender.com/e77x697。N₂首先被固氮酶（Step 1）还原为NH₄⁺，然后通过谷氨酰胺（Gln）合成酶-谷氨酸（Glu）合成酶途径并入碳骨架，在此过程中形成更多的含氮有机代谢物（Step 2）。NifHDK，固氮酶复合体；PEP羧化酶，磷酸烯醇丙酮羧化酶；2-OG，2-氧戊二酸；GS，谷氨酰胺合成酶；GOGAT，谷氨酸合成酶。

c 在BG11₀培养基中添加NaCl、NH₄Cl和Gln后细胞数量的增加。

d 在BG11₀、BG11₀（NaCl）和BG11₀（NaNO₃）中生长的细胞的固氮酶含量。

e 在有和无N₂通气的BG11₀和BG11₀（NaCl）中生长的细胞数量的增加。

f 在BG11₀、BG11₀（NaCl）和BG11₀（NaNO₃）中生长的细胞的固氮酶活性。一个单位（U）是催化1 µmol底物每分钟反应的酶的量。图表显示了平均值 ± 标准差，n = 3个生物学独立样本用于a、c和e，n = 6个生物学独立样本用于(d和f)。每个条形图上的不同字母代表通过单因素方差分析与Tukey’s HSD事后分析在所有测试的总体上计算出的统计显著性（p < 0.05）。源数据提供为源数据文件。

图中数据显示，在缺乏Na⁺的条件下，细胞内积累了更多的糖原，但却无法在黑暗中利用这些糖原来进行N₂固定。额外添加ATP能够刺激细胞生长，表明ATP的缺乏可能是N₂固定功能障碍的原因。

a 在BG11₀中生长的非N₂固定细胞或在含18克/升NaCl的BG11₀中生长的N₂固定细胞的细胞内糖原含量在昼夜循环中的变化。细胞在光照阶段结束时（L12）或黑暗阶段结束时（D12）取样。

b 在BG11₀中生长的细胞数量增加，或补充NaCl或ATP。    

c 在BG11₀ (NaCl)、BG11₀ (Gln)、BG11₀ (ATP)和BG110 (NaNO₃)中生长的细胞的固氮酶含量。

d 在BG11₀中补充等量的ATP、ADP或AMP后细胞数量的增加。图表显示了平均值 ± 标准差，n = 3个生物学独立样本用于a、b和d，n = 6个生物学独立样本用于(c)。每个条形图上的不同字母代表通过ANOVA与Tukey’s HSD事后分析在所有测试的总体上计算出的统计显著性（p < 0.05）。源数据提供为源数据文件。

图5 | NaCl对细胞ATP水平和ATP/ADP比率的影响

本图展示了NaCl对细胞内ATP含量和ATP/ADP比率的影响。在添加NaCl后，细胞内ATP含量和ATP/ADP比率显著增加，表明Na⁺在驱动ATP合成中的关键作用。使用Na⁺特异性离子载体和抑制剂处理的实验进一步证实了Na⁺在ATP合成中的重要性。

a 在黑暗中向BG11₀中添加NaCl后，N限制细胞的细胞ATP含量。

b ATP/ADP比率。

c 在BG11₀ (NaCl)中添加monensin（14 µM）后，黑暗阶段N₂固定细胞的细胞ATP含量。

d ATP/ADP比率。

e 在BG11₀ (NaCl)中添加EIPA（100 µM）后，黑暗阶段N₂固定细胞的细胞ATP含量。

f ATP/ADP比率。

图表显示了平均值 ± 标准差（n = 3个生物学独立样本）。

每个条形图上的不同字母代表通过ANOVA与Tukey’s HSD事后分析在所有测试的总体上计算出的统计显著性（p < 0.05）。

源数据提供为源数据文件。

图中展示了不同抑制剂对细胞生长的影响。Na⁺特异性离子载体和H+载体的添加显著抑制了细胞生长，表明Na⁺和H⁺耦合的ATP合成在细胞能量代谢中起着关键作用。

与未补充的细胞相比，在补充了monensin (a)、DTHB (b)、EIPA (c)或DCCD (d)的介质中生长的细胞数量增加。图表显示了平均值 ± 标准差（n = 3个生物学独立样本）。每个条形图上的不同字母代表通过ANOVA与Tukey’s HSD事后分析在所有测试的总体上计算出的统计显著性（p < 0.05）。源数据提供为源数据文件。

本图是Cyanothece sp.在不同条件下能量代谢的模型。在光照条件下，细胞通过H⁺能量学进行光合作用和有氧呼吸；而在黑暗条件下，细胞则依赖于Na⁺能量学和混合酸发酵来驱动N₂固定。这一模型解释了为什么Cyanothece sp.在沿海环境中能够在氮素稀缺条件下生存。

a 蓝藻（包括Cyanothece sp.）光合作用耦合的类囊体膜上典型H⁺能量学的示意图。在BioRender中创建。Tang, S. (2023) BioRender.com/n32k956。

b 提出的N₂固定Cyanothece sp.细胞质膜上的Na⁺能量学示意图，包括Na⁺梯度生成器和消耗器。在BioRender中创建。Tang, S. (2023) BioRender.com/n32k956。

缩写：RTO，呼吸末端氧化酶；Cyt b₆f，细胞色素b₆f；PC/Cyt c₆，质体蓝素/细胞色素c₆；PQ，质体醌；Fd，黄素二铁；NDH，NADH脱氢酶；Fum，延胡索酸；Suc，琥珀酸；SDH，琥珀酸脱氢酶；Glu，谷氨酸；Gln，谷氨酰胺；Ser，丝氨酸；Val，缬氨酸；Tyr，酪氨酸；Ala，丙氨酸；ATP，三磷酸腺苷；ADP，二磷酸腺苷；Pie，无机磷酸盐；Δψ，膜电位。