Hello小伙伴们大家好，今天我们来聊聊制备液相，虽然制备液相没有分析液相那么普及，这主要是由他们的不同用途决定的，但是在我们的科研及生产工作中，制备液相也是不可或缺的肱股之臣。
制备液相最常见的十个问题，来看看吧！
（图源：baotu）
1. 什么是制备液相
制备液相色谱是一种用于分离和纯化已知或未知物质的色谱技术。它主要应用于化学、生物学等领域，通过利用色谱柱的分离能力来去除杂质，得到高纯度的样品。制备液相色谱仪由溶剂瓶/桶、高压泵、进样系统、制备柱、检测器和馏分收集器、色谱数据处理系统等组成。
制备液相色谱示意图
2. 制备液相的用途是什么
与传统的纯化方法如过柱子、蒸馏、结晶等相比，制备液相也是一种有效的分离方法，其操作简单，灵敏度高。因此被广泛应用在高附加值样品，特别是某些药物杂质的提取和纯化上。
纯化规模 | 目标物质量 | 典型应用 |
分析级微纯化 | µg | 小规模药物研发实验中的 酶、多肽、生物大分子或 其他化合物分离 |
半制备型 | mg | 小规模生物检测、 结构解析和代谢物表征 |
制备型 | g | 分析参比对照品、 毒理学研究、化学物筛选、高纯度主成分/ 副产物的分离富集 |
工艺型 | kg | 工业规模的药物和 活性化合物生产 |
表1 色谱规模、目标物质量和相关应用
3. 制备液相与分析液相的区别是怎样的
制备液相和分析液相在原理上是一致的，但它们的最大差别在于目的不同：
分析液相 | 制备液相 |
定性☆☆ | 纯度☆☆ |
定量☆☆ | 回收率☆☆ |
峰形☆ | 分离通量☆☆ |
分离度☆ | 后处理便捷性☆ |
高灵敏度☆ | 化合物稳定性☆ |
合规性☆ | 成本☆ |
表2 分析液相与制备液相的主要区别
分析液相的目的和作用是为了做定性定量分析，因此分析液相关注的是分离度和灵敏度，分析液相往往追求更低的检出限，高灵敏度检测器一般可达到ng甚至pg级别。
制备色谱是指利用色谱方法分离出一定量达到足够纯度的化合物用于后续实验或处理的色谱方法。制备液相是利用色谱柱的分离能力，来去除杂质，得到高纯样品，在兼容分离度和灵敏度的同时，追求更大的制备效率 ，概括一下我们对制备液相的要求就是要达到“多（上样量）、快（制备速度）、好（馏分纯度）、省（溶剂使用）”实验效果。
项目 | 分析液相 | 制备液相 |
目的 | 定性、定量分析 | 分离、提纯 |
关注点 | 分离度、灵敏度 | 制备效率 |
作用 | 分析 | 去除杂质得到纯品 |
规格 | 10mL/min | 半制备50mL/min 制备≥100mL/min |
配置 | 泵、进样器、分析柱、 柱温箱、检测器 | 泵、进样器、制备柱、 检测器、馏分收集器 |
后续实验 | N.A. | 核磁等进一步的分析 实验提供足够纯度的样品 |
表3 制备液相与分析液相对比表
4. 制备液相的原理及实验流程是怎么样的
上样后，由流动相推动前进；样品中各组分经过固定相时，由于和固定相发生作用（吸附、分配、排阻、亲和、解吸）的强弱不同，导致在固定相里停留的时间也不同，使得其按照时间先后从固定相里流出来，借以实现分离！
实验流程：
5. 制备液相实验的关键参数有哪些
制备色谱分离的三个主要参数：纯度，回收率和上样量是制备色谱分离中三个主要的参数。
三个参数是一个三角的关系，根据分离目的不同，优化相应的三个参数。由于这些参数彼此依赖，纯化分离永远不可能同时优化这三个参数，需要通过巧妙的平衡来获得更优的效果。
6. 制备液相是如何分类的
根据不同类型和不同纯度要求样品的分离，通常可以根据使用时的系统压力分为低压、中压、高压等模式。通常在归类上会把低压，Flash以及中压制备色谱合称为中低压制备色谱。
低压（<2Mpa）：一般而言，低压适合易分离化合物，但分离时间长很容易造成敏感化合物分解。
Flash（<1Mpa）：也就是快速制备色谱，Flash是应对低压分离时间长而出现的替代方法，尽管其分辨率不及中压，仍常被用于简单的分离问题。
中压（<5Mpa）：中压一般采用恒流泵提供恒定的流动相流速，填料颗粒更小，分辨率更高，耐受更高压力和更快流速，操作与低压和Flash基本一致。
高压（>5Mpa）：高压通常在分离制备的最后阶段采用，进行精制纯化，应用于分离困难的样品，纯度甚至能达到99.9%，能承受的压力更高。
7. 制备液相的流动相应如何选择
1）选择流动相应保证目标化合物有良好的分离度和选择性。
2）挥发性的流动相保证后处理的简便。
3）流动相的蒸发残渣要尽可能的低，保证分离后产物的含量。
4）流动相粘度要低，保证低的柱压。
5）流动相的光谱特性与检测器兼容。
6）低成本与低化学惰性。
常用挥发性缓冲盐pH值 | |
三氟乙酸 | <2.2 |
甲酸 | 2.8-4.8 |
乙酸 | 3.8-5.8 |
甲酸铵 | 3.0-5.0 |
乙酸铵 | 3.8-5.8 |
碳酸铵 | 5.5-7.5 |
碳酸氢铵 | 8.3-10.3 |
氨水 | 8.2-10.2 |
在反相色谱系统中溶剂强度的顺序为水（最弱）＜甲醇＜乙腈＜乙醇＜四氢呋喃＜丙醇＜二氯甲烷（最强）。除了二氯甲烷与水不互溶外，上述溶剂可与水组合用于反相HPLC。最常用的还是乙腈/水和甲醇/水的组合。
其他选择，需考虑色谱分离后面还有提取的操作。避免使用高沸溶剂，高毒性溶剂，对密度差值相差大的多元溶剂也要尽可能的少用。
8. 样品后处理的常见方式与问题有哪些
1）样品后处理的方式
馏分的直接冻干
馏分的旋转蒸发
馏分的旋蒸加冻干
馏分的液液萃取后旋蒸
馏分的固相萃取后旋蒸
2）样品后处理中遇到的问题
馏分的溶液稳定性考察
馏分的全程稳定性考察
馏分的无机盐去除
馏分的避光处理
冻干后化合物转盐
9. 什么是浓度或体积超载
浓度超载：浓度过载，就是指在小体积进样时（体积未过载），由于进样浓度较高，靠近谱峰峰带的固定相被饱和，也就是说，进样某一组分超过了色谱柱的载样量而出现过载的现象。一般表现为色谱峰峰形拖尾，柱效较低。浓度超载中，样品的浓度增加了，但进样体积还保持不变。容量因子K'增大，峰形从高斯曲线变成三角形。只有当样品在流动相中有很好的溶解度时才能进行浓度超载。
浓度超载示意图
体积超载：进样体积太大通常会导致较宽的平头峰。另外体积过载还会影响峰保留时间，体积过载对保留时间短的组分影响更大，而对于较后面流出的峰影响较小。
浓度超载和体积超载都将导致化合物分离度的降低。由于化合物分离需要一定的分离度，所以在开发分析方法时优化分离度非常重要。选择性和超载的可能性相互依赖，改善选择性将增加一次运行能够分离的样品量。
10. 制备液相方法开发和放大比例的计算
在分析色谱中，加到色谱柱上的样品量一般是µg水平，也可以更少，化合物和固定相的质量比低于1：100000，所加样品的体积通常也远远小于柱体积（<1:100），在这种条件下，才能得到尖锐而对称的良好峰形。而制备液相最大的差异就是上样量要高很多。
纯化大量样品可以有两种方法：分析系统的按比例放大，或者柱超载。
用柱超载的方法即使在分析柱上也可以分离毫克级的样品。要制备更大量的样品，可以在此基础上再按比例放大。
将分析方法优化，并放大到制备方法分为三个步骤：
①优化分析方法的分离度
②在分析柱上进行柱超载
③放大到制备柱
如何计算按比例放大？
从一个较小内径的色谱柱过度到较大内径色谱柱时，必须放大的两个参数是流速和上样量。
好了，我们今天的十问十答就到这里了，关于制备液相，你有哪些宝贵的经验要分享呢？欢迎留言，精选留言将获得月旭科技送出的精美礼品，期待你的宝贵经验。
（图源：baotu）
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作者：赵桂芝
排版：赵林
审核：邵锋伟
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