基因组注释，即对基因组进行分析并预测基因的所在位置，对于基因组分析和基因功能研究至关重要。基因组注释是一套含有众多软件的综合性流程，涉及软件较多，且在软件安装、使用中均可能出现各类bug，从而导致低质量的基因组注释信息，甚至无法完成注释。目前，基因组注释流程的主要组成部分已在十几年内并未发生大的变革，更新方面主要涉及软件的更替，提升了效率和准确性。本系列推文将会针对基因组注释，进行一步步教学，并对可能出现的问题进行分析解释，从而帮助大家更好地进行分析，同时也欢迎大家的交流与讨论。这是本系列第一篇文章，将会对基因组注释流程进行整体上的介绍，从而理解分析的整体思路。基因组的组装质量是后续分析的基础，是得到可靠的基因组注释信息的重要前提。
基因组的组装质量可通过多维度的参数进行评估，如 N50, L50 等。同时，也存在一系列的软件进行组装质量的评估，包括：- BUSCO，目前最主流的基因组完整性评估软件，基于目标类群的部分物种基因组的保守同源基因进行构建。
- compleasm，李恒大佬改写的更快速、准确的 BUSCO 软件，与 BUSCO 基本一致，但速度显著提升，不过要注意参考库的改变。
- OMArk，2024年发表在NBT上的综合性评估软件，并且可以对污染和注释错误进行鉴定。
- LAI，利用长末端重复序列 LTR 进行基因组质量评估。由于 LTR 等重复序列组装与测序的挑战，LTR 序列的组装质量反过来可以反映基因组的组装质量。
上述软件通过各种方式去反映基因组的组装质量，但是基因组的准确性评估仍然存在挑战。
除单细胞测序外，参考基因组是各个细胞基因组的混合结果，其准确与否难以有效判断。并且依赖于基因的完整性评估，对于非编码区的评估仍然略显不足，这可能是后续研究的重点之一。
基因组可粗略分为：重复序列、基因区、基因间区。由于重复序列功能研究的有待深入，往往会将基因组中的重复序列进行屏蔽，以提高数据分析的效率，增加基因注释的质量和可靠性。RepeatModeler 和 RepeatMasker，最主流的综合性重复序列注释和屏蔽软件。RepeatModeler 负责结合从头证据、同源证据进行重复序列的预测，RepeatMasker 则负责根据上述注释结果进行屏蔽。EDTA，整合了上述软件在内的众多重复序列软件，进行更全面的注释与屏蔽。除了上述软件外，也存在如 LTR_retriever，DeepTE 等更针对性的重复序列注释软件，这需要根据具体的研究方向进行选择。
对于基因组注释而言，将重复序列进行预测和屏蔽就可以满足需求。
在获得屏蔽重复序列的基因组后，就可以对基因区进行基因结构的预测。目前，包括三种主要原理：转录组是基因存在的最直接证据，可靠性也最高，需要重点关注。目前，转录组测序包括二代和三代，但仍以二代测序为主。因此，流程包括两个主要步骤：1. 转录组的比对。二代测序数据比对较多，包括：
- Bowtie，用于小于50nt数据的比对，如小RNA文库，不适合常规转录组；
- Bowtie2，与 HISAT2 类似，使用范围和认可度也较高；
BWA，多用于重测序数据比对以及SNP分析。
2. 转录本组装及基因结构鉴定。在完成二代数据比对后，需要组装成完整的转录本，用于基因结构的鉴定。StringTie 是目前较为常用的软件，HISAT2 + StringTie 也是软件官方主推的流程。
2017年，Sayed 等对39个转录组分析工具进行了组合评估，得到了转录组分析的最优流程，如图（仅供参考）：
根据近缘物种的同源蛋白注释，也可提供较为可靠的基因预测证据。这类软件的原理都类似于 BLAST 比对，但在准确性和效率上存在较大差异。GenomeThreader，exonerate，genewise。这三个都是2010年以前发表的软件，在蛋白参考库规模较小的情况下，仍然有较好的表现。然而，由于基因组和基因数据集的大量扩增，其分析效率过低！！！严重影响分析进度。GeMoMa，较新的软件，并且用 java 编写，效率有所提升，但是使用起来不太方方便，不太理想，这里不做评论。miniprot，又是李恒大佬的作品。经过粗略测试，速度提升超过100以上，并保持了相当的准确性，极大地提升了分析效率。这一步的关键是蛋白参考库的选择，参考库较大的话，会造成假阳性较高，同时耗时过久；相反，则会注释不足
与上述两类方法相比，从头预测的准确性较低。但今年来，如 BRAKER 等综合性流程的整合，显著提升了从头预测的准确性。GeneMark，AUGUSTUS。这两个是过去主流的从头基因预测软件，并且目前也得到广泛的使用（软件安装极不友好）。BRAKER，整合了转录组、蛋白、从头预测的综合性注释流程，包含众多软件。结合同源蛋白和转录的证据，通过 GeneMark 进行初步训练和预测，再利用 AUGUSTUS 进行综合性分析，得到最终的基因结构证据。![]()
BRAKER流程示意图获得上述三种基因结构证据后，进行最终基因数据集的整合。EVidenceModeler 和 MAKER2 是目前常用的主流软件。这两个软件分别为 2008年和 2011年发表，并且表示近期不再更新。因此，有必要评估其替代选项。GINGER，EVidenceModeler 作者推荐的可替代流程，2023年发表在 DNA Research 上，有待进一步的验证。![]()
GINGER流程示意图由于基因组三种证据在不同情况下的可靠性不一，基因组注释整合软件在其分析中给不同证据所附的权重不同，也会对基因组注释结果的准确性产生影响。因此，该部分需要多次测试，以进行综合分析。
得到注释后的基因信息后，需要对基因进行功能注释，以满足后续基因功能的研究。这部分工作可利用本地软件或在线网站进行分析。InterProScan，综合性的基因功能注释软件，也有在线网站，包括众多数据库的信息，非常全面。eggNOG-mapper，综合性的在线注释平台，速度非常快，信息也非常全面，同时也在不断更新。唯一不足的是网站时不时会崩，导致无法访问。PANNZER，同样的在线基因组功能注释网站，也在保持更新中，不过上一次还是2021年，可以辅助上述网站一起使用。KEGG，基因通路注释。通路分析的必备，但是由于通路多以哺乳动物或模式动物为主，基因注释的比例较低。同时，还需要甄别非本类群物种的通路，否则会出现昆虫中的基因富集到人类疾病相关的通路中。Gene ontology，基因本体注释，也就是GO功能分析。与KEGG类似，在非模式物种中的作用达到降低。最后就是利用 BLAST 将蛋白序列与 NR，NT 或者 Uniprot 的库进行比对，并通过 Python 之类的脚本进行手动分析。基因功能注释还是以同源比对为核心进行分析，因此对于非模式物种而言，注释比例仍然较低，存在大量的无法注释的基因
基因组注释流程涉及众多软件的使用和参数的设置，难以得到一套标准化的参数对所有基因组进行最优地注释。因此，了解基因组注释中的每一部分的原理，才能有效地对自身研究，结合计算能力和基因组特性，进行针对性的软件和参数调整，提高最终基因组注释信息的准确性。本系列后续的文章将会以黑腹果蝇基因组为例，进行从零开始的基因组注释，欢迎大家的继续关注！一起共同进步！最后，欢迎大家提出宝贵的意见和建议，毕竟这还是我第一次写公众号推文，难免会经验不足，存在许多要改进的地方，欢迎大家的热烈讨论！可以留言或者直接私信！
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