2024年7月12日，Nature Communications上线了一篇关于大豆固氮机制的研究论文，“The type III effector NopL interacts with GmREM1a and GmNFR5 to promote symbiosis in soybean”。该研究表明，III型效应因子NopL通过与大豆中的GmREM1a和GmNFR5相互作用，促进结瘤因子的信号传导，为根瘤菌HH103建立结瘤因子介导的共生关系发挥了重要作用。大豆（Glycine max (L.) Merr.）作为一种重要的豆科作物，是人类和动物重要的蛋白质和食用油来源。为了实现大豆的高产，化学肥料被广泛使用，却忽视了其固氮共生能力。一个环境友好的农业策略应该寻求更好地利用大豆与根瘤菌的共生关系，以实现可持续的大豆生产。豆科植物和根瘤菌之间的共生，是通过相互识别和分子交互建立的。在这个过程中，豆科宿主植物分泌的黄酮类化合物，诱导根瘤菌产生结瘤因子（Nod factors, NFs），它们在与豆科植物建立共生相互作用中扮演核心角色。根瘤菌NFs被共生受体感知，从而引发信号级联，导致根毛感染和结瘤器官发生。紫花苜蓿（Medicago truncatula）的共生Remorin 1（MtSYMREM1）是根瘤特异性的，对于根瘤菌感染和细菌释放都是必需的。MtSYMREM1与NFP、LYK3和MtSYMRK相互作用，对于进入受体 LYK3 的稳定性是必要的，但这些复合体如何促成信号转导和特异性尚不清楚。除了NFs，其他根瘤菌信号分子也能影响与豆科植物的共生。，通过III型分泌系统（type III secretion systems, T3SS）分泌，之前在植物病原体中被描述，现在也在根瘤菌中被表征。根瘤菌中的III型效应因子（type III effector, T3E）也被称为瘤外蛋白（Nodulation Outer Protein, Nops），会被输送到宿主细胞中，以影响感染和根瘤形成。NopL是一种根瘤菌特有的T3E，其突变体或NopL磷酸化位点的突变，对菜豆（Phaseolus）根瘤的形成有负面影响并促进结瘤衰老。但是，NopL在豆科植物中的靶标及其功能背后的分子机制，尚不清楚。先前的研究表明，T3Es可以通过绕过NF识别在某些豆科物种中激活宿主结瘤信号，触发类似于NF介导的共生事件。这表明T3Es和NF介导的共生信号之间可能存在重叠，但T3Es行动的分子机制尚未得到描述。
图1. III型效应因子NopL促进大豆中的NF信号通路为了探究T3E NopL如何影响大豆中NF介导的共生信号传导，该研究首先在 Sinorhizobium fredii HH103菌株中构建了nopL、nodA（无法合成NFs）的突变体及nodAΩnopL双突变体。
用野生型（WT）HH103和突变体菌株接种大豆绥农14（SN14）后，突变体菌株形成的结瘤数量相比WT显著减少。然而，在接种后28天后（dpi），nopL、nodA和nodAΩnopL突变体与WT相比，在结瘤数量和干重上没有显著差异（图 1a，d和e）。
接下来，用WT HH103、nopL、nodA和nodAΩnopL的GUS标记菌株接种 SN14。与野生型菌株相比，不同突变体在接种1天后的侵染线（infection threads, ITs）和接种7天后的原基（primordia）数量上显著减少（图1b，c，f，g），这表明NopL在促进根瘤菌感染中扮演积极角色，通过 NF 信号级联促进感染线的形成和结瘤原基的发展。
图2. III型效应因子NopL通过分泌进入宿主细胞为了探究NopL是否被直接递送至大豆植株细胞内，遂使用WT或相应的nopL突变体，研究了接种1天后NopL在根毛细胞中的定位。检测到 NopL 蛋白存在于核和细胞膜的蛋白质组分中（图2a）。为了进一步证实NopL被转位到大豆细胞中，又开展了T3E-adenylate cyclase (Cya) reporter转位实验。结果显示，当用表达由NopL启动子驱动的NopL-Cya融合蛋白的HH103菌株（HH103 NopL-Cya）接种大豆根部时，可以检测到cAMP。而在用WT HH103或ttsI突变菌株接种的大豆根部，未检测到cAMP，说明ttsI突变体无法将NopL-Cya蛋白转位到植物细胞中（图2b）。由于NopL在菌株NGR234中参与了结瘤后期阶段的过程，故采用免疫组织化学和免疫荧光分析，测试了其在功能结瘤的感染细胞内的定位。这些研究指出，NopL被递送并主要存在于野生型结瘤的固氮细胞中（图2c-e）。使用与cyanine 3-conjugated IgG (Cy3-IgG)进行的免疫染色将NopL定位在细胞膜和核中（图2f-h）。这一结果通过透射电子显微镜下的免疫金标记技术得到了进一步确认，显示NopL与固氮体的膜、核以及胞质相关联（图2i-k）。所有这些结果都表明NopL可以被递送到大豆的根细胞内部。图3. NopL与REM1a和REM1b的物理相互作用为了解析其中的调控机制，通过pull down-MS鉴定到了NopL的互作蛋白GmREM1a（MtSymREM1的同源蛋白）。图4. GmREM1a是DN50中NopL作用所必需的与野生型相比，大豆突变体Gmrem1a接种HH103以及其突变体后，在根瘤数目以及侵染线数目上均没有显著差异。在野生型大豆中，过表达NopL并接种HH103以及nopL突变体，可以有效地增加根瘤数目。然而，接种nodA以及nodAΩnopL突变体的菌株，产生的根瘤数目不会显著增加。并且在Gmrem1a背景下，过表达NopL接种HH103或者其突变体均不会有效增加根瘤数目。这些结果表明NopL介导的NF信号的功能依赖于GmREM1a。图5. NopL与MtNFR5的同源蛋白GmNFR5相互作用进一步的研究发现，NopL通过与大豆Remorin 1a（GmREM1a）和NF受体NFR5（GmNFR5）发生物理相互作用，可以加强GmREM1a与GmNFR5之间的互作，并且促进GmREM1a在nanodomain上招募GmNFR5。图6. NopL促进GmREM1a与GmNFR5的相互作用此外，NopL和NF影响GmRINRK1的表达，后者是与Lotus RINRK1同源的受体样激酶（LRR-RLK），在介导NF信号传导中起作用。图7. 对WT和rem1a突变体在感染HH103或nopL突变体24天后的根部进行RNA-seq分析综上所述，S. fredii的NopL能够与NF信号级联中的组分相互作用，以促进大豆中的共生相互作用。该研究为深入理解大豆与根瘤菌共生建立提供了新的视角，也为今后高效共生固氮的大豆遗传改良，以及高匹配性的根瘤菌菌剂的研发提供了理论基础。
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