细菌和噬菌体作为自然界中相爱相杀的一对老冤家，在进化的旅程中，一直致力于军备竞赛。细菌发展出了多条防线来应对噬菌体的入侵，例如restriction-modification（限制性修饰）、abortive infection（流产感染）以及大家熟知的CRISPR系统等等，当然是噬菌体也发展了anti-CRISPR类似的系统来应对。
Jens Hör作为第一作者的文章——Bacteria conjugate ubiquitin-like proteins to interfere with phage assembly ，最近在Nature见刊。他们详细的阐述了BilABCD系统对抗噬菌体入侵的机制。
BilABCD作为一个细菌操纵子，包含四个蛋白（Ubl、E2、DUB、E1）。DUB具有去泛素化功能，BilB（E2）蛋白作为最终将Ubl类泛素化蛋白转移到目标蛋白的赖氨酸上，代表BilABCD操纵子能够完成完整的泛素化/去泛素化功能。
为了详细研究BilABCD系统的机制，作者在E.coli中表达了分离自Collimonas sp. OK412的四基因操纵子（Ubl/BilA, E2/ BilB, DUB/BilC,E1/BilD）,Ubl蛋白与人源的泛素蛋白相似性很高，包含两个类泛素结构域，最重要的是C端末端的功能性甘氨酸在Ubl（BilD）的所有同源物中都高度保守，C端的G163是Ubl连接到目标蛋白的功能位点。
作者得到了确定的E1和Ubl的作用，下一步的泛素化过程是E2蛋白和Ubl的互作，遗憾的是，实验中没有探测到E2和Ubl形成的复合体。功能上的实验能够补充说明这个泛素化系统是能够正常工作的（E2蛋白C113A位点突变后细菌抗病毒能力减弱），关于E2蛋白和Ubl蛋白的互作证据可能需要进一步的实验才能解析。最后一步，Ubl蛋白与目标蛋白的结合，是我们随后要讲的文章的内容。
作者通过表达Bil系统的E.coli来观察Bil的表达量，相比于其他的防御系统，BilABCD在病毒入侵时的表达量和常规的防御系统是同一水平的。它在正常的防御过程中发挥着重要的作用，
确认了泛素化过程实际存在于原核过程中，作者随后进行了一系列实验探究泛素化是如何干扰噬菌体侵染的。泛素化蛋白要发挥它的作用，需要结合到噬菌体蛋白上。我们可以自然的提出两个问题：Bil是怎样影响侵染过程的？Ubl蛋白结合到什么蛋白上？
作者首先从Bil系统的免疫特征入手。Bil的免疫周期与Abi（r abortive infection）系统类似，但是相比于对照组细胞，表达Bil系统的宿主细胞并没有提前裂解，说明Bil系统干扰了有侵染能力的噬菌体子代的形成，但是不是通过提前诱导细胞死亡的机制。
随后，作者对用SECphi27噬菌体侵染后的Bil-E.coli上清液进行CsCl梯度离心。成熟的噬菌体作为对照，只有一条条带。不同的是，在Bil-E.coli组中，出现了两条带，其中一条带的位置与对照组一致，另外一条密度更大一些，如果对Bil系统进行失活突变，高密度条带会消失。为了研究高密度条带中的噬菌体是否发生了活性变化，在CsCl梯度中的每一条条带都被分离出来进行功能实验。
首先，实验人员使用NTA（nanoparticle tracking analysis ）——一种纳米级别的颗粒技术手段，对不同条带的噬菌体颗粒数量进行同单位的计数，然后使用噬菌斑检验标志噬菌体的侵染能力。这两个参数集合就能更表征，每个噬菌体条带的总体感染能力。
从上图中可以看见Bil组相对于野生型和突变组，噬菌体数量和侵染能力都下调了，高密度条带中几乎失去了侵染能力，而且这种下调不仅出现在了高密度条带中，还出现在了低密度条带中。暗示着，Bil系统对噬菌体的防御是很全面的，即使是装配好的、分子量正常的噬菌体也会受到影响。
百闻不如一见，旁敲侧击的研究了Bil系统对噬菌体的修饰后，作者决定使用负染电镜直接观察它们的形态。电镜下，Bil系统攻击过的噬菌体，在高密度条带中呈现出尾部丢失的形态，相比之下突变组和对照组中的形态是完整的。“身首异处”的情况也再次印证了功能实验中高密度组较差的侵染表现。那为什么噬菌体尾巴没有了，反而密度增加了呢？尾部是蛋白为主体的，它的丢失增加了核酸在全体质量中的比例，密度自然上调。种种证据都指向：Bil系统可能影响了噬菌体装配的过程。
Ubl结合的蛋白到底是什么呢？接下来的WB实验给出了答案。作者将侵染表达Bil防御系统细胞的噬菌体收集，针对带有HA标签的Ubl蛋白进行pull-down显影，得到了一条150kDa大小的条带。而对于蛋白有限的噬菌体来说，满足大小在130KDa作用的蛋白只有一个，CTFalso called the spike protein or tip attachment protein)，一个识别宿主、组成噬菌体尾部的双功能蛋白。为了反向验证，他们给CTF蛋白加上了3×FLAG标签再次进行WB，得到了相差20kDa的CTF蛋白条带，印证了泛素化修饰的假设。进一步的验证是通过对噬菌体进行抗Ubl蛋白的胶体金抗体孵育之后的电镜观察，能够看到Ubl蛋白都是结合到噬菌体的尾部的。
CTF作为双功能蛋白，对它泛素化修饰直接干扰尾部的正常装配，但是对于那些装配完成的噬菌体是Bil进程又是如何影响其活性的？作者猜测，泛素化还影响CTF参与的宿主识别、DNA注射过程，事实也如预期一般,被Bil干扰后的噬菌体，注射DNA的能力确实下降了很多，下图a中清晰的展现了这一点。
至此，BilABCD对抗噬菌体侵染的故事也差不多结束了。BilABCD系统以高度类似真核生物ISG15系统的泛素化方式有效抵抗了噬菌体病害，CTF蛋白是它准确的目标位点，可惜的是，这篇文章没有详细的讨论DUB蛋白以及operon中缺失的E3蛋白的功能是如何被补偿的。
而和这篇文章同时发表的背靠背文章——A eukaryotic-like ubiquitination system in bacterial antiviral defence，对这些略过的内容做了讨论，下面让我们来一起看看这篇文章。
Raymond T. Suhandynata5 & Kevin D. Corbett此前的研究发现了和BilABCD结构类似的细菌操纵子，得益于AlphaFold2的发展，他们预测了操纵子四个蛋白的结构，发现与真核生物的泛素化相关蛋白是高度相似的。为了确定这个操纵子是不是和细菌免疫相关，他们以其中的E1蛋白序列作为基准，进行了多基因组范围内的筛选，试图找到包含E1同源蛋白的相似操纵子，结果在Ensifer aridi TW10菌里发现了136个满足条件的序列。经过PADLOC server注释，这些位点大多和免疫相关，且受到DNA损伤信号的激活，也就侧面提示，这个操纵子是参与到细菌免疫中的。因为结构与BilABCD系统类似，作者也就将它命名为BilABCD type-Ⅱ，随后的比对发现二者虽然序列高度相似，只是蛋白的进化同源性不高。这也说明，这两个系统在功能上的研究是具有强烈的相互提示作用的。
作者通过纯化type-Ⅱ型BilABCD系统的不同蛋白，得到了他们的结构特征。其中，将E1、E2、Ubl蛋白一同表达的时候能够获得三聚体。在这里，我们分别描述E1、E2、Ubl蛋白的结构特点。
E1BilD 包含一个 N 端的非活性腺苷酸化结构域（IAD）和一个 C 端的活性腺苷酸化结构域（AAD），两者形成了一个结构上相关的伪二聚体。E1BilD 的最接近的结构亲缘体是人类的泛素和 FAT10 E1 UBA6，以及异二聚体的 NEDD8 E1 NAE1–UBA3。像这些真核 E1 蛋白一样，E1BilD 在 AAD 中具有一个单一的活性腺苷酸化位点，其中一个关键的精氨酸残基（Arg9）由 IAD 提供。CYS 结构域通过柔性的连接件与 AAD 相连，显示出较高的移动性，在不同结构形式（form 1 和 form 2）中呈现不同的位置。尽管 E1BilD 缺少许多真核 E1 蛋白中常见的附加结构域（如 IAD 中的第一个催化半胱氨酸半结构域或螺旋卷结构域，以及介导 E2 结合的 C 端泛素折叠结构域），其整体结构与典型真核 E1 蛋白的相似性暗示了一个共同的进化祖先。
E2BilB 的折叠模式与经典的 E2 蛋白（如酿酒酵母和人类的 E2 蛋白）相似。它的保守 CEHH 基序包含了 Cys138、Glu144、His146 和 His151 残基，这些残基在 E2BilB 中起到了重要的结构和功能作用。E1BilD 的 C 端附近的一个环和 α 螺旋通过由 Cys340 和 Cys343（位于 AAD 交叉环）以及 Cys491 和 Cys493（靠近 E1BilD 的 C 端）协调的 Zn2+ 离子得到稳定。这一稳定性对于 E2BilB 的结合至关重要。在 E1BilD–E2BilB–UblBilA 复合物的 form 2 结构中，E1BilD 的 CYS 结构域从腺苷酸化活性位点旋转开，其假定的催化半胱氨酸（Cys138）与 E2BilB 的催化半胱氨酸相邻。结构中，这两个残基通过二硫键连接，这一状态模拟了 E1 到 E2 转硫酯化中间体的结构状态，其中 E1 和 E2 的催化半胱氨酸残基彼此接近到大约 2 Å。
与已知的 I 型 BilABCD 操纵子的 Ubl（如 BilA）不同，这些 Ubl 通常包含两个预测的 β-抓握结构域，而 E. aridi 的 UblBilA 仅包含一个 β-抓握结构域。在 E1BilD–E2BilB–UblBilA 复合物的结构中，UblBilA 以类似于已知的 Ubl–E1 复合物的方式与 E1BilD 结合，其 C 端定位于 E1BilD 的腺苷酸化活性位点。UblBilA 在结构上与真核生物的泛素和 SUMO 蛋白更加相似，而不是细菌的 β-抓握蛋白 ThiS 和 MoaD。具体而言，UblBilA 与真核同源物的 Cα 均方根偏差（r.m.s.d.）为 1.7 Å，而与细菌同源物的 r.m.s.d. 为 3.3 Å，这表明其与真核蛋白更为接近。
在随后的纯化实验中，我们发现E1、E2、Ubl共表达的系统中出现了除了三条主要条带以外的弥散条带，作者怀疑，这是被修饰的目标蛋白。
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41586-024-07730-4
https://www.nature.com/articles/s41586-024-07616-5
如有叙述错误，敬请批评指正！
文字：刘霁
编辑校对：Chirs
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