研究进展
通过热拉丝工艺（TDP）和热锥形工艺（TTP）制造了具有各种设计的多功能锥形探头。图2a显示了预制件的制造步骤。加工聚碳酸酯（PC）棒以创建空心通道以及镶嵌波导和电极的空间。然后将带有PC磁芯（折射率n = 1.59）和聚（2-甲基丙烯酸甲酯）和铋锡（BiSn）合金电极的波导插入各自的位置。然后将瓶坯包裹在PC薄膜中，并在真空炉中固结。通过TDP，最终的预制件被加热并拉成直径为2 mm的光纤。在TTP过程中，微型瓶坯被加热、软化和拉动以形成锥形结构。该工艺改编自加热玻璃移液器和锥形石英光纤的制备方法。后端直径为 2 mm 和 150 μm 锥形尖端，用于监测和操纵神经活动。1.为了满足高质量神经记录的阻抗要求，电极的直径至少为25μm。然而，推动流体通过微流体通道所需的压力与通道半径成正比和流体粘度。在这项研究中，递送了载体和具有高粘度的CP-55,940，我们选择了直径为~40 μm的药物通道，以确保稳定可靠的药物递送。在这项研究中，制造了三种不同设计的探针（分别为8/1/1、8/4/8和0/8/12;电极/波导/微流体通道）。电极、微流体通道和光波导的尺寸分别为 ~25 μm、30–50 μm 和 30 μm。器件尖端横截面如图所示。BiSn电极记录细胞外电压，而光波导控制光遗传学，微流控通道使局部药物输注成为可能。
图2. 采用热锥形工艺制造的T-DOpE探头
为了评估T-DOpE探针在体内的功能，收集了行为小鼠的急性和慢性电生理活动。探针植入靶向海马体的CA1区域。图3b显示了来自CA1的急性宽带（0.1-8000 Hz）细胞外迹线的示例，该示范表明，当SPW-R发生时，从静止状态转变为θ振荡出现时的运行状态。阴影区域 i.在原始迹线中显示多单元活动（即，在0.1–8000 Hz下滤波的带通）。阴影区域 ii.和 iii.表示振荡，这些振荡被确定为识别海马 CA1 的电生理标志36,37,73：SPW-R（ii.，100-250 Hz）和θ嵌套伽马振荡（iii.，θ：6-11 Hz，Gamma：40-80 Hz）。因此，T-DOpE 探针可以在行为动物中获取单个单元和局部场电位（LFP）活性，而不会破坏局部电路内的自然生理过程。
我们还在 CA1（n = 2 只动物）中长期植入了 T-DOpE 探针，以证明其生物相容性和长期稳定的单单位记录能力。每个电极的波形以及自相关和互相关表明，探针在43天内记录了同一组神经元。检测到的单位范围为 1-7 个单位（中位数 = 3），其中 57.9% 的单位被确定为推定的锥体细胞，42.1% 被确定为推定的中间神经元。经验证的峰值排序指标74报告了隔离距离（μ = 26.9， σ = 9.7）以及违反尖峰间隔（<2 ms， μ = 0.53%， σ = 0.61%）的尖峰百分比。这些数据表明， T-DOpE探针具有足够的生物相容性和稳定性，可以在不破坏局部电路的情况下进行纵向实验。
为了验证 T-DOpE 探针中的光波导，在 ChR2 表达仅限于 CA1 锥体神经元的小鼠中记录了 CA1。在这些实验中，探针被推进到四个最腹侧的电极位于CA1锥体层中心上方~100μm处，而四个最背侧的电极仍保留在覆盖的皮层中。图4a显示了来自三个光刺激强度水平（即激光功率）的代表性光学诱发神经反应。通过调节光刺激功率，能够调制单个单位的尖峰速率。请注意，最低光功率不会引起动作电位，而中高光功率会增加发射速率。图4c显示了对三个光学能级的局部场电位响应示例。正如预期的那样，在皮层中没有观察到光学诱导的反应，因为 ChR2 表达定位于 CA1。在 CA1 中，光刺激诱导 LFP 发生较大的负偏转，这可能是由于阳离子通过 ChR2 流入和表达 ChR2 的神经元中的活性膜电导，以及由 ChR2+ 细胞释放的谷氨酸激活的突触后神经元中的突触诱发的内向电流。CA1 PYR的光遗传学激活诱导了CA1的局部高频纹波振荡。这些发现证明了探针能够监测和操纵局部电路，同时保留局部电路的生理功能。
观察到在输注生理盐水、载体或药物载体后短暂缺乏尖峰。输注前后两个细胞的尖峰波形和自相关性。它们波形和自相关性的相似性表明它们是相同的中间神经元和锥体细胞。重要的是，波形形状的微小变化可能是由于组织在空间抖动下位移并返回到同一位置，从而通过欧姆脑组织的有效电阻发生变化。然而，这种抖动可能在数十微米的范围内，这解释了基线和恢复峰值的相似性。值得注意的是，这是对实验设计的重大改进，实验设计需要远离记录部位的药物输注，使得效应点难以解释。
当 CA1 接收到 CA3 的强兴奋性输入时，会产生 SPW-R，CA3 对 CA1 PYR 的树突去极化产生尖锐波，以及兴奋性锥体神经元与局部 GABA 能抑制性中间神经元之间由于 CA1 内相互作用而产生的快速振荡。虽然结果证实，在海马内输注后，自发的 SPW-R 率降低，但目前尚不清楚这是否是由于源自 CA3 输入的突触末端表达的 CB1R 信号传导和/或海马中间神经元。为了解决 CA3 输入的变化是否可以解释 SPW-R 的降低，将 CA1 PYR 的 CA3 尖波激发与直接 ChR2 去极化代替。我们使用 T-DOpE 探针在 CP-55,940 输注前后对 ChR2 + CA1 PYR进行光遗传学去极化。将头部固定的AAV-CamKII-ChR2小鼠放在轮子上，将473 nm激光连接到T-DOpE探头，以将光脉冲传递到CA1中。基线30分钟后，CA1锥体细胞在40分钟内以低、中和高功率的150 ms光脉冲进行光刺激。最后一次光刺激后 10 分钟，CP-55,940被局部注入。一旦组织从输注中恢复，就会使用相同的光功率水平传递另一组光脉冲。会话的频谱图是在叠加纹波速率的情况下计算的。请注意，由于光学诱导的 SPW-R，在 40-70 分钟内检测到的 SPW-R 事件增加。输注 CP-55,940 后，SPW-R 事件的发生率急剧降低，相同的低、中和高光脉冲不足以光学诱导 SPW-R。光刺激在之前和之后激活网络的程度相同，这可以从对相同光脉冲的平均光学 LFP 响应没有差异这一事实中看出。重要的是，这表明药物后未能产生 SPW-Rs 并不是由于无法充分去极化 CA1 神经元。还计算了小波变换，并在所有会话中取平均值，以可视化光学诱导的SPW-R。图8f显示了高光脉冲下基线和药物输注后的光谱。在较高的光脉冲强度下，基线和药物后输注之间的差异更大。这些数据进一步支持CA1中间神经元表达的CB1R激动作用是激动剂诱导的SPW-R抑制机制。
总结和展望
在这里，通过可扩展且低成本的热锥形方法制造了T-DOpE探针。该方法在探头设计中实现了高度的通用性和复杂性，半自动连接方法确保了T-DOpE探头的可扩展性。我们的体内研究表明，T-DOpE探针的可靠和精确记录以及同时进行光学和化学操作以了解复杂的神经回路，具有希望的未来实验。在这里，使用 T-DOpE 探针研究了 CA1 CB1R 信号传导在行为动物的海马活动中的作用，包括 theta 和 SPW-R。结果表明，CB1R信号在CA1电路产生纹波的能力中起着关键作用。
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