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Western Blot（WB）的中文名为蛋白质免疫印迹实验，是分子生物学中最常用的蛋白质检测技术。WB通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白样本按分子量大小进行分离，随后转移至固相载体上，经过抗体的免疫杂交和显色反应指示蛋白质的大小和含量，以评估细胞和组织中蛋白的表达情况。
Western Blot的第一步为蛋白提取，提取方法根据检测目标的类型可分为总蛋白提取、核蛋白提取、膜蛋白提取，对于大多数应用进行总蛋白提取即可。
总蛋白提取所需的试剂为：裂解液、蛋白酶抑制剂。
▲裂解液
裂解液的成分主要有Triton X-100、NP-40、SDS等，不同裂解强度和实验应用范围的裂解液成分有所差别，裂解液的原理为利用表面活性剂破坏细胞膜的脂质双分子层，使细胞破裂，释放并溶解细胞内的蛋白。
由于细胞破碎后会释放出细胞本身存在的蛋白酶，为了保护蛋白样本不被降解，需要在裂解液中加入蛋白酶抑制剂来抑制蛋白酶的活性。蛋白酶抑制剂的成分主要有PMSF、AEBSF、aprotinin、leupeptin、pepstantin、EDTA等。
对于需要检测磷酸化蛋白的Western Blot应用，还需在裂解液中加入磷酸酶抑制剂。
注意事项：为了避免蛋白质的降解，蛋白提取操作过程应尽量保持低温。
Western Blot的第二步为电泳，进行电泳是为了将蛋白质按不同分子量大小进行分离，以进行后续的检测。
凝胶电泳需要配置聚丙烯酰胺凝胶，配置凝胶的试剂为：丙烯酰胺-双丙烯酰胺（Arc-Bis）、SDS、Tris-HCl缓冲液、过硫酸铵（APS）、四甲基乙二胺（TEMED）。
在配置好凝胶液时，TEMED会催化APS释放自由基，使Arc-Bis聚合和交联，形成类似网状的结构，凝胶中所含丙烯酰胺的百分比越高，凝胶网状结构的孔径越小，分子量大的蛋白迁移速率就会更慢。
▲SDS-PAGE凝胶
凝胶通常分为两部分：浓缩胶和分离胶，浓缩胶的作用是将加样孔中的样品聚集至同一电泳起点，即浓缩胶和分离胶的分界线，一般浓度为5%。
分离胶的作用是将样品按分子量大小进行分离，根据所分离的蛋白分子量选择适合的分离胶浓度，参考如下：
不同浓度的分离胶配方如下（单位mL）：
浓缩胶配方如下（单位mL）：
蛋白样本在进行电泳前还需要加入上样缓冲液（Loading Buffer）及加热变性，上样缓冲液中含有SDS、DTT、溴酚蓝等成分，SDS可与蛋白质结合，使蛋白质带上大量的负电荷，同时还能断开蛋白质分子的氢键，DTT可以断开蛋白质中的二硫键。上样缓冲液破坏了蛋白质的二级和三级结构，使得电泳速度只与蛋白分子量有关。
▲电泳过程
操作步骤：
注意事项：
配置凝胶时的TEMED具有毒性和挥发性，应在通风橱中加入，APS和丙烯酰胺也有一定毒性，需佩戴好手套防护，由于凝胶配置需要一定熟练度，推荐使用预制胶以获得更好的结果。蛋白样品的变性时间不宜过长，否则会引起蛋白交联和降解。
Western Blot的第三步为蛋白转印，将蛋白质从电泳后的聚丙烯酰胺凝胶转印至对蛋白质有很强亲和力的聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，以便进行后续的检测，蛋白转印方法可分为湿转、半干转、干转。
湿转适合各种分子量的常规转印，转印时凝胶和PVDF膜浸入装满转印缓冲液的转印槽中，缺点是转印时间较长，大分子量蛋白甚至需要过夜转印。
半干转使用转印缓冲液润湿的滤纸包夹凝胶和PVDF膜，通常10分钟即可完成转印，缺点是大分子量转印较慢。
干转不需要转印缓冲液，转印时间比半干转进一步缩短，但需要特殊的耗材，花费较高。综合时间和物料成本的考量，我们实验室通常使用半干转进行蛋白转印。
▲半干式转印仪
Western Blot的最后一步为免疫杂交及检测，当蛋白质转印到PVDF膜后，依次使用一抗、二抗进行免疫杂交，然后使用化学发光进行条带的成像，得到最终的实验结果。
由于PVDF膜对蛋白具有很强的亲和力，未转印上蛋白质的区域在后续的抗体孵育过程中可能会吸附抗体，造成检测时背景高甚至出现非目标条带的情况，因此在抗体孵育前需对PVDF膜进行封闭，封闭后会将未转印上蛋白质的区域也结合了无检测活性的蛋白质，常用的封闭液为TBST配置的2.5-5%脱脂牛奶。
完成封闭后将进行一抗和二抗的孵育，一抗的作用是特异性识别目标抗原，随后带有辣根过氧化物酶（HRP）的二抗特异性识别一抗，HRP能作用于化学发光底物形成光信号，通过胶片或成像系统进行光信号的捕捉，形成蛋白条带。
注意事项：
封闭液的浓度及封闭时间、一抗和二抗的稀释浓度及孵育时间均应根据实验结果进行调整。化学发光工作液配置后不稳定，应立即使用。
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华仁医学提供基础医学联合科研服务，科研团队具有成熟的Western Blot实验技术，可进行高质量蛋白的高效提取，同时为样品设置预实验，根据具体情况微调确定最佳的样品上样量和抗体稀释度等各项实验参数，保证检测结果客观准确。
