基因组 DNA 是生命的蓝图，对基因组 DNA 实现任意尺度的精准操作代表对生命蓝图进行修改绘制的底层能力，是基因工程技术发展的核心。以 CRISPR 基因编辑技术为代表的技术进步已经基本实现了单碱基和短序列尺度的精准编辑。然而，如何针对应用场景的需求，实现大片段基因尺度的 DNA 在基因组的高效精准整合，仍然是整个基因工程领域亟需突破的难题。如果该技术得到突破，意味着可以通过外源功能基因的精准写入来干预涵盖不同位点多种突变谱的基因所导致的遗传缺陷等疾病，从而开发更为通用的基因与细胞疗法，具有广泛的应用前景。
针对这一重大技术挑战，多种基因写入技术已被开发，但是这些技术大多依赖于 DNA 模板作为基因写入的供体（donor）。在实际医学应用中，DNA 供体面临免疫原性高、在体（in vivo）递送困难、在基因组中具有随机整合风险等诸多挑战。相比之下，RNA 供体具有更低的免疫原性、可被非病毒载体有效递送、在细胞内迅速降解，无随机整合风险等特点，能有效应对 DNA 供体所面临的挑战。因此，以 RNA 为供体的大片段精准写入技术，在安全性、可递送性方面都具有显著的优势。然而，现有以 RNA 为供体的技术，要么无法实现>200 bp的 DNA 片段高效整合（如引导编辑等），要么依靠基因组随机整合从而带来基因组随机突变风险（如逆转录病毒等）。是否能够以 RNA 作为供体，实现功能基因尺度的大片段 DNA 基因组精准定点整合？仍然是基因工程领域面临的挑战。
R2 逆转座子是真核生物中广泛存在的一种以 RNA 作为媒介的逆转座子，它专一性地“定居”在宿主 28S rDNA 基因组位点上，借助宿主基因的启动子,合成自身的 RNA 和蛋白质并组装形成 R2 复合物。R2 复合物可再次识别宿主 28S rDNA 上的专一性位点,通过逆转录合成 cDNA, 将 R2 基因序列重新整合到宿主基因组上,完成“增殖”。这一机制与以 RNA 作为供体的基因写入工具的开发思路不谋而合，同时，28S rDNA 位点在人基因组中拷贝数目多（约 219 个），且远离蛋白编码基因，是适合于外源基因整合的安全港位点（"safe harbor" loci）。因此，R2 逆转座子是以 RNA 为供体的大片段基因精准写入工具开发的有力的候选者。然而，尽管 R2 逆转座子早在上世纪 80年 代就被发现，其在哺乳动物细胞中的功能性质尚未被系统性地探索，迄今为止，未能被利用来在哺乳动物细胞中实现大片段功能基因的有效整合。
2024 年 7 月 8 日，Cell 杂志以长文形式在线发表了北京干细胞与再生医学研究院/中国科学院动物研究所李伟研究员与周琪研究员团队合作完成的题为 All-RNA-mediated Targeted Gene Integration in Mammalian Cells with Rationally Engineered R2 Retrotransposons 的研究论文。该研究结合基因组数据挖掘和大分子工程改造等手段，开发了使用 RNA 供体进行大片段基因精准写入的 R2 逆转座子工具，能够在多种哺乳动物细胞系、原代细胞中实现大片段基因（>1.5 kb）高效精准的整合，最高效率超过 60%，成功实现了全 RNA 介导的功能基因（DNA）在多种哺乳动物基因组的精准写入，为新一代创新基因疗法的发展提供了基础。
在本研究中，研究团队首先通过数据挖掘，全面系统地分析了自然界中 R2 逆转座子元件的生物多样性；通过构建基于 RNA 供体的基因写入的报告体系，成功筛选出在哺乳动物细胞中具有完整 GFP 基因整合活性的 R2Tg 系统（来源于一种鸟Taeniopygia guttata 的基因组）。为了探究影响 R2 整合活性的因素，研究团队从 R2Tg 系统的供体 RNA 与 R2Tg 蛋白两方面做了系统性探究与工程化改造。对于 R2Tg 供体 RNA 中的 UTR 元件，研究团队首先通过 SHAPE-MaP 实验以及多序列比对，绘制了 UTR 的二级结构。结合序列删减或位点突变，发现 5’ UTR 中含有 HDV 样核酶，并且在 R2 的整合过程发挥重要的功能。同时，研究团队发现删除 3’ UTR 中的一段茎环结构可以显著提升 R2 在哺乳动物细胞中的逆转座效率。对于 R2Tg 蛋白，研究团队使用 AlphaFold2 预测了 R2Tg 蛋白的三维结构，结合 R2 蛋白质进化信息，在 R2 蛋白中引入氨基酸点突变，或者偶联与核酸结合或加工相关的小蛋白结构域，均成功提高了 R2 系统的活性。结合上述工程化的供体 RNA 与蛋白进行进一步优化，研究团队最终获得了在人细胞系中超过 20% 基因整合效率的 en-R2Tg 工具。
系统的工程化改造获得 en-R2Tg 工具
由于 R2 蛋白质可以通过 mRNA 表达，且供体 RNA 本身也是 RNA，那么，en-R2Tg 工具能否以全 RNA 形式介导的基因的高效精准写入？为了探究这一点，研究人员通过体外合成获得了编码 R2 蛋白质 mRNA 以及供体 RNA，并使用脂质体递送的方式将两条 mRNA 导入人的细胞中。结果显示，en-R2Tg 工具能够高效整合多个与疾病治疗相关基因，且这些基因能够有效表达功能蛋白。能够以全 RNA 的形式发挥功能，意味着 en-R2Tg 工具可以使用安全性已经在临床上得到证明的 LNP 纳米材料来进行递送，这将有可能解决长久以来基因写入工具依赖病毒载体进行高效递送的难题。研究团队发现，使用 LNP 递送 en-R2Tg 工具在人的肝脏细胞系中能够实现 25% 的基因整合效率。此外，研究团队还证明 R2 工具在人类原代细胞中同样具有活性；同时，通过显微注射将 en-R2Tg 工具导入小鼠胚胎，成功实现了超过 60% 的 GFP 基因定点整合效率。
本研究的另一关键点在于，工程化改造的 en-R2Tg 工具是否还保留有天然 R2 逆转座子的 28S rDNA 位点特异性整合这一性质？为了回答这一问题，研究人员结合无偏好的基因整合富集高通量测序以及全基因组三代测序方法，发现 en-R2Tg 工具在全基因组范围内展现了极高的基因整合特异性，大于 99% 的外源基因都精准整合到 28S rDNA 安全港位点。同时，结合 qRT-PCR 以及 RNA-Seq 实验，研究人员发现 en-R2Tg 工具对细胞的转录组状态几乎没有影响。这说明 en-R2Tg 介导的基因写入是位点精准特异的，可以有效避免逆转录病毒等技术所产生的基因随机整合导致的基因突变风险。
综上，该研究基于自然界存在的 R2 逆转座系统，结合数据分析和工程化改造方法，成功开发了全 RNA 介导的、高效精准的基因写入技术，首次在多种人和小鼠细胞系及原代细胞中实现了功能基因的定点整合。R2 基因精准写入工具在递送和安全性方面具有显著优势，未来有望基于此工具开发在体功能基因回补写入以及在体生成 CAR-T 细胞等全新的疾病治疗方法。值得注意的是，R2 基因写入技术目前无法实现在不同基因组位点的可编程写入，且在人原代细胞中的基因写入效率较低，因此未来需要进一步发展和优化。
开发全 RNA 介导的、高效精准的哺乳动物细胞大片段功能基因写入工具
该研究由北京干细胞与再生医学研究院与中国科学院动物研究所合作完成，中国科学院动物研究所博士后陈阳灿、博士生骆胜球、博士后胡艳萍、博士生毛邦炜、王鑫阁与卢宗宝为本研究共同第一作者，北京干细胞与再生医学研究院/中国科学院动物研究所李伟研究员与周琪研究员为共同通讯作者。该研究工作得到科学技术部、国家自然科学基金委员会、中国科学院、北京市自然科学基金等的大力支持。
编辑： 刘智清
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