自 1948 年 Barbara McClintock 首次报道转座子以来，这类跳跃遗传元件对宿主演化的重要意义逐渐被揭示。其中，DNA 转座子作为主要类型之一，长期以来备受关注。
DNA 转座子也称为“跳跃基因”，约占人类基因组的 2%，是一种天然的可以自主移动的 DNA 序列，通过单链或双链 DNA 中间体在生物体的基因组中移动。DNA 转座子不仅贡献于物种基因组的大小，在与宿主基因组长期进化的过程中，可以演化为功能性基因或调控元件，同时 DNA 转座子跳跃造成的基因组不稳定性也是物种进化的重要动力，有助于宿主适应恶劣环境。然而，在长期演化的过程中，绝大多数的 DNA 转座子失去了转座活性，只有少数转座子被开发为基因整合的工具，用于基因治疗、诱导 iPS 细胞、制备转基因动物、挖掘新的基因和功能元件等。
目前，由于以往多为个案研究，DNA 转座子活性的决定因素与进化模式的一般规律尚不清晰。尽管DNA 转座子可作为基因工程工具用于插入诱变或转基因载体，但目前只有 Sleeping Beauty（SB）等少数几种转座子得到了开发和广泛应用。因此，系统挖掘具有不同功能特点的转座子工具亟待开展。
2024 年 6 月 5 日，中国科学院动物研究所张勇和北京干细胞与再生医学研究院/中国科学院动物研究所王皓毅研究组在 Cell 杂志上在线发表题为 “Heterologous survey of 130 DNA transposons in human cells highlights their functional divergence and expands the genome engineering toolbox” 的研究论文。
DOI：https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.05.007
该研究从 102 个无脊椎或脊椎动物基因组中预测了 130 个潜在活跃的候选 DNA 转座子。实验筛选验证从中发现了 40 个可在人源细胞中活跃转座、具有我国自主知识产权的新型转座子；这一集合将哺乳动物中活跃转座子载体的数目从 20 提升至了 60，大幅拓展了其进化多样性。研究团队进一步开展了基础研究与应用研究两个层面的系统探索，一方面解析了 DNA 转座子的活性相关因素和进化动态，揭示了其多样化的功能特征；另一方面也阐明了 Mariner2_AG（MAG） 在 CAR-T 细胞治疗中的优越性能和临床应用潜力。
活性转座子的挖掘、系统刻画及工具应用的全流程
具体而言，研究团队首先建立了遗传多样性数据的挖掘模式（图1A），基于生物信息分析从 102 个无脊椎和脊椎动物基因组中预测了 130 个潜在活跃的 DNA 转座子；人源细胞中的高通量实验筛选进一步验证了 40 个转座子具有异源转座活性（图1B）。其中，来自蚊子的 Mariner2_AG、来自洞穴鱼的 Tc1-2_St 等转座子活性超越了经过大量优化的 SB100X。
图1. 系统筛选活跃DNA转座子。A）预测活跃 DNA 转座子的生物信息学分析流程。B）实验验证体系及 40 个活跃 DNA 转座子的转座活性。
这一结果将哺乳动物中活跃转座子载体的数目从 20 提升至了 60，大幅拓展了其进化多样性（图2）。研究团队通过比较活跃与不活跃的转座子，发现高活性 DNA 转座子富集在 Tc1/mariner 超家族；这与该超家族转座子频繁发生水平基因转移的特点相吻合。在转座子的来源物种、家族、年龄和完整拷贝数等各类进化信息中，拷贝数最能准确预测其在人类细胞中的活性有无。
图2. 130 个新型 DNA 转座子和 20 个已知活跃 DNA 转座子的进化树。
研究者探究了影响转座活性的序列特点。在 Tc1/mariner 超家族中，转座子末端的反向重复（TIR）如果相对较长并在内部编码正向重复（IR-DR），那么该转座子更有可能有活性（图2、3A），且其活性也较强（图3B）。除了非编码区特征外，研究者也在转座酶编码区证实了 Tc1 家族和 hAT 超家族中对转座活性具有重要影响的已知功能性位点，同时还报道了更多新的功能氨基酸（图3C）。
图3. 活跃转座子的固有属性。A）Tc1/mariner 超家族转座子的四种 TIR-DR 结构。B）Tc1 家族中，具有长 TIR 和短 TIR 的活跃转座子的转座效率分布情况。C）Tc1 家族活跃转座酶的保守残基。
考虑到其作为基因工程工具的潜在可能，研究者进一步探究了新型转座子的整合偏好性和基因承载能力等功能属性。来源于不同超家族的高活性转座子展示出三种整合偏好模式（图4）：一是接近于随机的整合模式，如 Tc1 家族成员；二是偏好于异染色质区域，如 piggyBac-1_AMi 转座子；三是偏好于转录活跃区域，如 hAT 超家族成员。这些 DNA 转座子的整合偏好性差异代表其在不同领域的应用潜力，例如第三种转座子可用于增强子或基因定位分析。基因承载能力分析则显示出活性最高的 Mariner2_AG 在该方面的明显优势：其在承载 10kb 的外源基因时仍可表现出高达 30% 的转座效率。
图4. 不同家族高活性转座子的插入偏好。
研究团队最后对 MAG 转座子用于 CAR-T 细胞治疗的能力进行了初步探索，揭示了其作为基因治疗载体的优越性（图5）。相比于常用的慢病毒和 SB100X 载体（特别是前者），MAG 转座子制备的 CAR-T 细胞在人 Burkitt's 淋巴瘤细胞系 Raji 构建的血液瘤模型和人肺鳞癌细胞系 NCI-H226 构建的实体瘤模型中展现了更佳的治疗效果与更长的存活时间。
图5. MAG 转座子制备的 CAR-T 细胞功能评估。A）CAR-T 细胞制备及功能评估流程。B）接种人 Burkitt's 淋巴瘤细胞系 Raji 的小鼠在接受不同处理后的荷瘤情况。C）接种人 Burkitt's 淋巴瘤细胞系 Raji 的小鼠在接受不同处理后的生存曲线。D）接种人肺鳞癌细胞系 NCI-H226 的小鼠在接受不同处理后的肿瘤体积变化。
综上所述，该研究基于自然界的动物遗传多样性开展了迄今为止最大规模的 DNA 转座子活性筛选，从而获得了目前最大的活跃 DNA 转座子数据集；这不仅揭示了与转座活性相关的进化因素和功能特征，还扩展了基于 DNA 转座子的遗传工具箱。
该研究由北京干细胞与再生医学研究院、中国科学院动物研究所、中国科学院大学、北京中医药大学、四川大学华西医院等机构合作完成。中国科学院动物研究所博士生张童童、副研究员谭生军、助理研究员唐娜、博士生李源清为本研究共同第一作者，中国科学院动物研究所张勇研究员和北京干细胞与再生医学研究院/中国科学院动物研究所王皓毅研究员为共同通讯作者。张晨泽、孙晶、郭言言、高晖、蔡瑜佳、孙文、王晨鑫、傅良政、马慧静、吴亚超、胡晓璇、张雪纯、Peter Gee、闫卫华、赵亚辉、陈强、郭宝成等合作者在文章写作、实验和计算分析等方面提供了大力支持。该研究得到了自然科学基金（32325014）、农业农村部（2023ZD0407401）、重点研发计划（2019YFA0802600，2019YFA0110000）、科学院（ZDBS-LY-SM005，XDA16010503）等项目资助。
编辑： 刘智清
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