一作专访
陈阳灿博士
本期一作专访嘉宾是陈阳灿博士，刚刚在 Cell 发表研究 All-RNA-mediated Targeted Gene Integration in Mammalian Cells with Rationally Engineered R2 Retrotransposons。
DOI:https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.06.020
该研究开发了使用 RNA 供体进行大片段基因精准写入的 R2 逆转座子工具，能够在多种哺乳动物细胞系、原代细胞中实现大片段基因（>1.5 kb）高效精准的整合，成功实现了全 RNA 介导的功能基因（DNA）在多种哺乳动物基因组的精准写入。未来有望基于此工具开发在体功能基因回补写入以及在体生成 CAR-T 细胞等全新的疾病治疗方法。
陈阳灿博士在采访中剖析了科研过程中的难点、大数据工具的应用，探讨了技术类研究的优势，更以一线青年科研人员的身份回答了对突破“卡脖子”和抢占“科技制高点”等使命的认识。
以下为采访的全部内容：
01
怎么关注到逆转座子这个细分领域的？研究思路是什么？
陈阳灿：
现有靶向基因写入技术主要依赖 DNA 作为供体。在实际应用中，DNA 供体面临免疫原性高，体内递送困难，具有随机整合风险等诸多挑战。相对于 DNA 供体，RNA 供体具有更低的免疫原性、可有效被非病毒载体递送且在细胞中快速降解等优势，因此我们想开发一种以 RNA 为供体的靶向基因写入技术。由于 RNA 供体最终要以 DNA 的形式整合在基因组中，因此我们把目光聚焦于同样基于 RNA 中间体来实现 DNA 整合的逆转座子系统。
绝大部分逆转座子都是随机整合在基因组中，然而，有一些逆转座子，比如 R2 逆转座子，天然专一地整合在 28S rDNA 位点。这一位点在人基因组中拷贝数目多（约 219 个），且远离蛋白编码基因，是适合于外源基因整合的安全港位点（"safe harbor" loci）。因此，R2 逆转座子是以 RNA 为供体的大片段基因写入工具开发的有力的候选者。
我们总体的研究思路是：通过数据挖掘与分析获得 R2 逆转座子的名单；建立哺乳动物报告系统进行活性筛选；对候选的 R2 逆转座子进行活性优化；最后对优化的工具进行特异性以及应用评估。
02
目前的研究成果中，
最让你惊喜的是哪个部分？
陈阳灿：
我们通过建立哺乳动物报告系统对多种 R2 逆转座子进行活性筛选，发现这些 R2 逆转座子在哺乳动物细胞这种异源环境中要么没有活性，要么效率很低（<3%）。因此，我们意识到需要对这些系统加以改造，来提升它们的效率。
但是当时我们面临的情况是，R2 逆转座子虽然在 20 世纪 80 年代就已经被发现报道，但是它在哺乳动物中的性质几乎没有被探索过，我们没有过往的文献可以参考。
比较幸运的是，我读博期间主要的工作是开发与优化新型的 CRISPR-Cas 基因编辑工具，在过往的工作中，积累了一定的蛋白质与 RNA 工程化改造的经验。这些宝贵的经验也为我们开展这一全新的 R2 逆转座子系统的优化工作提供了信心与参考。
我们通过系统性的 RNA 和蛋白质工程，成功地将一个原本活性较低的 R2 逆转座子改造成了一种有效的基因写入工具。更让我们惊喜的是，我们最终优化的工具能够有效兼容 LNP 非病毒递送载体，以全 RNA 的形式在人的肝脏细胞系中实现了 ~25% 的基因整合效率。
03
整个研究过程中，最困难的是什么？
又是怎么突破的？
陈阳灿：
最困难的部分主要还是效率问题。我们发现，自然状态下的 R2 逆转录转座子在异源细胞环境中写入基因的能力很弱，这使得我们几乎无法进行后续的工作。
因此，我们这项工作的目标之一就是如何去提高 R2 逆转座子在哺乳动物细胞中的基因整合效率。R2 逆转座子工具发挥作用需要两个组分，一个是 R2 蛋白质，另一个是 RNA 供体，这与我们过往所研究的 CRISPR-Cas 基因编辑工具的组成成分很类似。借由过往的经验，我们以源自一种鸟类基因组的 R2 系统（R2Tg）为起点，从 RNA 供体和蛋白质两个角度系统对 R2 的活性的进行优化。
然而，在准备优化工作的时候，我们面临很大的一个难题：R2 系统的三维结构并没有得到解析。没有结构信息，就好比修建房子没有设计图纸，难以进行工程化设计。比较庆幸的是，当时的生命科学领域迎来了一项革命性的进展，AlphaFold2 技术出现了，这使得我们能够有机会对一些新型未被探索过的蛋白质的结构做比较精准的预测。因此，我们利用 AlphaFold2 对 R2Tg 蛋白的三维结构进行预测，并结合序列比对确定该蛋白每个结构域的边界。获取了蛋白质设计的图纸之后，我们采取了多种途径进行改造，例如引入氨基酸突变来提高蛋白对核酸底物的亲和力、融合一些与核酸结合或加工相关的小蛋白，通过这些方式我们从蛋白的角度成功提高了 R2Tg 的整合效率。
另外一个问题是，当时 AlphaFold2 无法直接对 RNA-蛋白质复合物的结构进行预测。因此，我们利用多序列比对以及一种名为 SHAPE-MaP 的实验方法，预测了 RNA 供体中的的 5'和3' UTR 的二级结构信息，从而获得了 RNA 供体的改造图纸。然后，我们通过删除 3' UTR 中的一个大茎环结构，也成功提高了 R2Tg 的效率。
更加让我们兴奋的是，当我们将供体 RNA 和蛋白质的优化方式叠加在一起的时候，发现 R2 系统的整合效率得到了更大程度的提高，最终我们获得了优化版本的 R2 工具。
04
技术类探索跟一般的机制探索，有何不同？
陈阳灿：
二者的出发点不一样。技术类探索一定要以需求为导向，更侧重于开发和优化具体的工具或技术，以实现特定的功能或应用，如在本研究中开发基于 R2 逆转录转座子的基因整合工具，关注的是如何提高 R2 系统的基因整合效率等，使其能有效地应用于哺乳动物细胞中的基因编辑。一般机制探索则更注重揭示生物过程背后的基本原理和机制，例如研究 R2 逆转录转座子在细胞中进行逆转座的具体分子机制、其与宿主基因组的相互作用以及对细胞状态的影响等。两者相互关联，技术类探索往往需要基于对机制的一定理解来进行优化和改进，而技术的发展也可以为机制探索提供更先进的手段。
我自身对技术类的探索有十分浓厚的兴趣。当今世界的科技发展迅速，但仍有许多未被满足的需求有待解决。聚焦这些需求，发明一项技术，实现重要功能，并在实际中取得应用，这是一件让人很有成就感的事情。
05
生命科学研究进入大数据驱动时代，在你的研究中，大数据发挥了什么样的作用？
陈阳灿：
大数据在本研究中扮演了重要的角色，贯穿了整个工作。
例如，我们的工作起始于对 R2 逆转座子系统进行系统发育分析。这需要我们从数据库获取 R2 元件的序列，通过蛋白质的提取、进化分析，最终确定我们需要通过实验进行测试的候选名单。进一步，为了对 R2 系统进行工程化改造，我们需要获取供体 RNA 和蛋白质的结构信息来指导我们进行改造优化。此时，我们同样需要借助大数据分析的手段，来对 RNA 和蛋白质的结构进行计算预测。同时，在评估 R2 逆转座子基因整合的特异性与精准度时，我们建立了一套无偏好的高通量测序方法，通过分析这一方法产生的庞大的数据，我们得以确定R2工具的整合是非常特异的。
总之，大数据在研究中帮助我们深入了解 R2 系统的生物多样性、进化关系、在宿主基因组中的整合特征以及其在细胞中的功能表现等，为研究提供了全面和深入的视角，有助于发现规律和指导进一步的实验设计。
随着人工智能、高通量测序等技术的发展，在未来，大数据在技术类探索的研究中肯定会扮演更加重要的角色，我们应该与时俱进，积极拥抱新的技术。更重要的是，我们要更加深度地思考急需解决的科学问题，从问题与需求出发，才能更好的利用好大数据相关的平台与技术。
06
对工具的探索是不是也有
应对“卡脖子”的考量？
陈阳灿：
在当前激烈的科技竞争格局下，实现高水平科技自立自强是我国迈向科技强国的关键一步。而对工具的探索与创新，正是达成这一目标的核心要素之一。国外的“卡脖子”问题往往体现在对关键技术和工具的垄断或限制出口，导致我国在某些领域的发展受到阻碍。因此，自主探索和开发工具可以帮助我们突破这些限制，实现技术的独立和自主发展。在一些关键领域，如生物医药、信息技术等，拥有自主可控的工具和技术对于国家安全和发展至关重要，可以避免因依赖国外技术而面临潜在的风险。
总之，对工具的探索是应对“卡脖子”问题的关键途径，能够推动我国科技的自主创新，保障国家的安全和发展利益，这正是我们开展工具探索工作的初心所在。基因编辑技术尤其是大尺度的 DNA 操控技术是整个基因工程领域的科技制高点，这项工作是我们朝着这个目标努力奋斗的成果之一，我们希望以此工作为起点，继续开发与优化新的技术，并持续推进自主开发的技术在临床疾病治疗方向的转化应用，为健康中国的建设贡献力量。
07
作为一线青年科研人员，怎么理解“抢占科技制高点”，践行总书记提出的“发展新质生产力”的要求？
陈阳灿：
“抢占科技制高点”意味着在前沿领域取得突破性进展。对于生物技术而言，则是开发出自主创新的技术和工具。这需要我们不断探索未知，挑战现有技术的局限，理解国家的重大需求，追求更高的科学目标。生物技术作为当今科技领域的前沿之一，在农业、医疗、工业等多个领域的广泛应用和不断创新，为“新质生产力”的发展注入了强大动力，为解决人类面临的各种挑战和实现可持续发展提供了有力支撑。
以医疗领域为例，生物技术的发展为该领域带来了革命性的变化，使得许多疑难杂症有了新的治疗方法和药物。例如，单克隆抗体药物的研发成功，为癌症、自身免疫性疾病等的治疗带来了新的希望。基因编辑与基因治疗技术也在逐步走向临床应用，为遗传性疾病的根治提供了可能。这些生物技术的创新成果不仅提高了医疗效果，还带动了整个医疗产业的发展，形成了“新质生产力”。
作为新时代的科研工作者，我们应以“抢占科技制高点”作为奋进目标，勇于探索新技术和新方法，持续创新、不断突破；同时，我们要注重将科研成果与实际应用相结合，推动科技成果的高效转化和广泛应用，为“发展新质生产力”贡献自己的力量。
编辑： 刘智清
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