含碳燃料不完全燃烧产生的炭黑纳米颗粒（CBNPs）是大气污染物气溶胶中碳颗粒物质的主要成分之一，具有不溶性和稳定性的特性，同时炭黑广泛应用于橡胶、塑料和油墨等的制造，在生产使用过程中进入环境，具有潜在的健康风险。孕期作为一个特殊的生理时期，对多种环境污染物的暴露具有易感性，特别是孕期暴露污染物可能对子代的健康造成危害。有研究证实母体孕期暴露炭黑可诱发子代包括呼吸系统在内的多个系统损害或异常，然而其潜在的毒理学机制尚不清楚。据此，本研究通过建立孕期动式吸入暴露炭黑的大鼠模型和在体-离体生物感受细胞模型，探讨孕期暴露炭黑致子代肺组织纤维化的作用及相关机制。研究结果表明，母体孕期炭黑暴露后，子代肺组织内DDRGK1介导的内质网自噬升高进而诱发EMT和纤维化。机制上，母体孕期炭黑暴露导致m5C甲基转移酶NSUN2水平的升高，从而提升了SP1 mRNA的m5C甲基化水平；随后，Ybx1分子通过识别SP1 mRNA的m5C修饰位点促进SP1的翻译；SP1作为转录因子结合DDRGK1基因启动子并促进DDRGK1表达，进而诱导内质网自噬的发生；最终内质网自噬通过诱发持续的内质网应激而导致子代肺组织内EMT和纤维化水平的升高。这些新的发现为更深入探讨母体孕期暴露炭黑致子代呼吸系统疾病的机制研究提供了新的视角（图1）。![]()
本研究实验设计如图2A所示。成年雌性和雄性大鼠以2:1比例合笼饲养至雌鼠怀孕，将孕鼠分为对照组（Ctrl）和炭黑纳米颗粒暴露组（CB）。对照组和炭黑纳米颗粒暴露组孕鼠从怀孕第0.5天（GD0.5）起至仔鼠出生（PND0），分别吸入洁净空气和浓度为5 mg/m3的CBNPs，暴露时间为6 h/d。孕鼠分娩后哺乳仔鼠至断乳（PND21），对仔鼠肺组织和血液样本取材进行后续研究。
暴露仓内的CBNPs粒径分布和监测的浓度变化情况如图2B所示。
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图2 实验设计和暴露仓内的CBNPs粒径分布及浓度变化A：本次研究的简明设计方案。B：暴露仓内的CBNPs粒径分布及浓度变化。HE染色结果发现：孕期CB暴露组的子代肺组织出现炎性细胞浸润、肺泡壁增厚和肺泡结构破坏现象。与对照组相比，肺组织病理损伤程度分值更高（图3A）。检测EMT标志物，包括E-cad，N-cad和Vimentin蛋白以评估EMT水平。研究结果表明：与对照组相比，孕期CB暴露组的子代肺组织内的N-cad和Vimentin水平升高，而E-cad水平下降（图3B，C），这一结果证实了母体孕期炭黑暴露可导致子代肺组织发生EMT。![]()
图3 母体孕期炭黑暴露诱导子代肺组织病理损伤和EMT标志物水平升高A：子代鼠肺组织的病理组织学改变。B：肺组织EMT标志物表达。C：RLE-6TN细胞EMT标志物表达。肺组织Masson染色结果发现：与对照组相比，孕期CB组的子代肺组织内胶原纤维占比增加（图4A）；进一步对两组纤维化标志物，包括α-SMA和Collagen I蛋白进行检测，结果显示：与对照组相比，孕期CB暴露组的子代肺组织内的α-SMA和Collagen I水平均升高，说明母体孕期炭黑暴露可致子代肺组织肺纤维化水平升高（图4B，C）。![]()
A：子代肺组织的马松染色和胶原纤维水平。B：子代肺组织纤维化标志物表达。C：RLE-6TN细胞内纤维化标志物表达。持续的内质网应激可导致EMT，而持续内质网应激可由过度的内质网自噬所引起。据此，本研究探索了母体孕期炭黑暴露是否可导致子代肺组织内质网自噬。首先，我们对自噬的代表性蛋白，包括ULK1，Beclin1，Atg5和LC3，以及内质网自噬的标志性蛋白DDRGK1进行了检测，实验结果表明，与对照组相比，孕期CB暴露组子代肺组织中的上述蛋白表达水平均高于对照组（图5A-D），提示孕期CB暴露可以引起子代肺组织内质网自噬增加。
体外构建内质网自噬串联报告系统（EATR），采用mCherry-eGFP-RAMP4质粒转染后观测eGFP和mCherry荧光表达，通过计算eGFP：mCherry荧光强度比值，判定内质网自噬。研究结果显示：与对照组相比，孕期CB暴露组子代血清处理的大鼠肺上皮细胞（RLE-6TN）内质网自噬水平升高，而在加入siDDRGK1后，内质网自噬明显恢复。Co-IP实验证实DDRGK1能够与内质网自噬受体蛋白FAM134B结合，提示DDRGK1的内质网亚结构域可与FAM134B的结合关系（图5E-F），调控内质网自噬。![]()
图5 母体孕期炭黑暴露诱导子代肺组织内DDRGK1介导的内质网自噬A：母体孕期炭黑暴露后子代肺组织内自噬相关蛋白表达。B：RLE-6TN细胞内自噬相关蛋白表达情况。C：子代肺组织内质网自噬流相关蛋白表达。（C1）LC3和DDRGK1蛋白代表性western blot条带。（C2-C3），LC3和DDRGK1蛋白相对定量分析。D：RLE-6TN细胞内质网自噬流相关蛋白表达情况。E：DDRGK1和 FAM134B免疫共沉淀。F：RLE-6TN细胞DDRGK1对内质网自噬的作用。（F1），表达EATR的代表性细胞荧光图像。（F2），mCherry+eGFP-(red)/mCherry+eGFP+(yellow)点面积相对定量分析。与对照组相比，孕期CB暴露组子代血清处理的RLE-6TN内质网分布弥散不连贯并伴随示踪染色模糊和出现点状聚集，证实内质网结构的破坏，而在加入siDDRGK1后恢复明显；免疫荧光结果表明，与对照组相比，孕期CB暴露组子代血清处理的RLE-6TN内，内质网功能指示蛋白p-IRE1α和p-PERK表达升高，而在加入siDDRGK1后明显降低。以上结果说明了母体孕期炭黑暴露后，通过DDRGK1介导的内质网自噬而导致上皮细胞内质网结构的破坏和功能的紊乱（图6A，B）。
与对照组相比，孕期CB暴露组子代血清处理的RLE-6TN细胞EMT和纤维化水平升高，而在加入siDDRGK1后明显降低，说明了内质网自噬正向调控EMT和纤维化水平（图6C，D）。![]()
图6 母体孕期炭黑暴露后子代肺组织内DDRGK1介导的内质网自噬对EMT和纤维化水平的影响A：RLE-6TN细胞内质网结构变化。B：RLE-6TN细胞内质网功能蛋白变化。C：RLE-6TN细胞DDRGK1对p-IRE1α，p-PERK和 EMT标志物表达。D：RLE-6TN细胞DDRGK1对纤维化标志物表达的影响。通过JASPAR生物信息学网站预测到SP1蛋白结合到DDRGK1基因启动子部分的可信度最高，结合位点分别位于距转录起始点的1.76 Kb和1.9 Kb处。利用ChIP-qPCR实验发现上述两个位点均有富集产物，而且距转录起始点1.76 Kb的富集产物更高（图7A，B）。
与对照组相比，母体孕期炭黑暴露后子代肺组织内SP1蛋白水平升高。RT-PCR结果发现母体孕期炭黑暴露后子代肺组织内DDRGK1 mRNA水平升高，而在加入siSP1后，DDRGK1 mRNA水平下降，提示SP1作为转录促进因子调控了DDRGK1基因的表达（图7C，D）。![]()
图7 母体孕期炭黑暴露后子代肺组织内SP1正向调控DDRGK1 mRNA表达A：转录因子SP1与DDRGK1启动子的两个结合位点。（A1）图形表示的SP1结合的基序。（A2-A3），SP1结合的两个DDRGK1启动子的核苷酸序列。（A4），SP1在DDRGK1启动子富集相对定量分析。B：SP1蛋白对DDRGK1 mRNA的影响。通过RNAm5Cfinder数据库，预测到SP1 mRNA上存在m5C甲基化位点。MeRIP-qPCR实验结果表明，与对照组相比，母体孕期炭黑暴露后子代肺组织内SP1 mRNA的m5C甲基化水平升高（图8A）。NSUN2是催化mRNA CDS区m5C形成的主要甲基转移酶，本研究结果发现，与对照组相比，母体孕期炭黑暴露后子代肺组织内，NSUN2水平升高，SP1 mRNA的m5C甲基化水平升高；而在加入siNSUN2后，m5C甲基化水平明显降低，提示NSUN2正向调控SP1 mRNA的m5C甲基化水平（图8B-D）。同时发现，与NC组相比，加入siNSUN2后，SP1 mRNA的半衰期明显缩短，而且在加入Act-D后的1h，2h和4h的三个时间点的SP1 mRNA水平均明显降低（图8E），说明NSUN2可以影响SP1mRNA的稳定性。![]()
图8 NSUN2调控SP1 mRNA的m5C甲基化水平并维持SP1 mRNA的稳定A：子代肺组织内SP1 mRNA的m5C甲基化。（A1），m5C最高可信度甲基化位点预测。（A2），SP1 mRNA的m5C甲基化水平相对定量分析。（A3），m5C甲基化机制图解。B：子代肺组织内NSUN2表达。C：RLE-6TN细胞内NSUN2表达。D：RLE-6TN细胞SP1 mRNA的m5C甲基化水平相对定量分析。E：经siNSUN2处理的RLE-6TN细胞内SP1 mRNA稳定性分析。Ybx1作为m5C甲基化的识别蛋白，可以识别并稳定靶RNA，进而促进其表达。RIP-qPCR实验发现，与对照组相比，孕期CB暴露组子代血清处理的RLE-6TN内SP1 mRNA上Ybx1富集增加。而且与NC组相比，加入siYbx1后，SP1 mRNA的半衰期明显缩短，加入Act-D后的1h，2h和4h的三个时间点的SP1 mRNA水平均明显降低（图9A）。孕期CB暴露组子代血清处理的RLE-6TN内SP1蛋白表达升高，在加入siYbx1后，出现水平的降低（图9A，B）。孕期CB暴露组子代血清处理的RLE-6TN内，内质网自噬和纤维化水平均升高，而在加入siNSUN2后均呈现降低趋势（图9C，D）。 ![]()
图9 Ybx1的富集对m5C修饰的SP1 mRNA的影响和NSUN2对RLE-6TN内质网自噬及纤维化水平的影响A：母体孕期炭黑暴露后子代肺组织内Ybx1在m5C修饰的SP1 mRNA上富集的定量分析。B：Ybx1对SP1蛋白表达的影响。（B1），经siYbx1处理的RLE-6TN细胞内SP1 mRNA稳定性分析。（B2），SP1蛋白代表性western blot条带。（B3），SP1蛋白相对定量分析。C：经孕期炭黑暴露的子代血清处理的RLE-6TN细胞内NSUN2对DDRGK1调控的内质网自噬的影响。（C1），DDRGK1蛋白代表性western blot条带。（C2），DDRGK1蛋白相对定量分析。D：经孕期炭黑暴露的子代血清处理的RLE-6TN细胞内NSUN2对纤维化水平的影响。（D1）α-SMA和Collagen I代表性western blot条带。（D2-D3），α-SMA和Collagen I蛋白相对定量分析。
