转自：ENV. One Health

Perfluorohexanesulfonic Acid (PFHxS) Induces Hepatotoxicity through the PPAR Signaling Pathway in Larval Zebrafish (Danio rerio)

PFHxS通过PPAR信号通路诱导斑马鱼仔鱼肝毒性

通讯作者：南方科技大学 裘文慧 教授

Disscussion

PFHxS与广泛的不良健康影响有关，已成为环境和人类样本中最常见的PFAS同系物之一。本研究首次表明，PFHxS对斑马鱼的典型毒性是通过肝毒性诱导途径实现的，通过整合RNA测序、形态学、生理学、生化技术，并利用特定的转基因斑马鱼系，全面研究了PFHxS在斑马鱼肝发育过程中的作用，从而对其进行了评估。在本研究中，我们发现暴露于PFHxS会导致斑马鱼早期肝脏形态异常和肝功能紊乱，这与转录变化预测的效果一致。我们的研究结果表明，PFHxS可以显著影响鱼类的肝脏发育、功能、炎症和基因表达，因此有必要对PFAS类似物的生态风险进行评估。

转录组学分析是阐明未知性质化学物质作用机制的有效方法。先前的研究表明，转录组学技术能够预测全氟化合物对斑马鱼的毒理学影响。在本研究中，基于转录组学方法，大泡性肝脂肪变性和肝脂肪变性被预测为斑马鱼幼虫暴露于PFHxS后的最高富集靶点。肝脏在外源性物质的代谢和解毒中起着关键作用。肝脂肪变性，也称为脂肪肝，其特征是肝细胞中脂肪的积聚。在更严重的情况下，肝脂肪变性可导致严重的肝损伤，进展为肝硬化甚至肝细胞癌。

脂滴的基本作用是储存脂质，甘油三酯和胆固醇是不可或缺的成分。然而，脂滴的异常积聚会导致肝脂肪变性。我们观察到暴露的仔鱼肝脏中脂滴的积聚，进一步表明PFHxS可以诱导鱼类的肝脂肪变性。据报道，PFOS暴露与斑马鱼的肝脂肪变性和甘油三酯含量呈正相关，而PFOA暴露同样会诱导小鼠的肝脂肪变并升高甘油三酯水平。此外，TC和TG对肝脏中的脂质合成和储存至关重要，是脂质稳态的生物标志物。先前的研究表明，PFOS显著提高了斑马鱼的TC水平，而PFOSA会导致仔鱼TC和TG水平升高。TC主要以HDL-C和LDL-C的结合形式在血液中运输。Apoea是编码ApoE蛋白的基因，在胆固醇清除中起着至关重要的作用。Sunny H等人报道，小鼠ApoE缺乏会导致显著的胆固醇积累，从而促进动脉粥样硬化的发展。暴露于10μg/L PFHxS后，斑马鱼中apoea的表达显著下调，这进一步表明PFHxS暴露后促进了脂质积累。

TC和TG水平的变化与脂质分解代谢基因的表达密切相关。先前的研究表明，TBPH可以通过上调关键的脂质代谢基因（如pparg、acox3和cpt1aa）来降低TC和TG水平，这些基因促进脂质分解和脂肪酸氧化。pnpla2、cpt1aa和acox1基因在脂肪分解途径中起着关键作用。在0.1μg/L PFHxS暴露后，pnpla2和acox1的表达显著下调，而在1μg/L时，cpt1aa和pnpla2的表达均显著下调。转录谱的这种下调可能有助于抑制暴露于PFHxS的斑马鱼的脂质代谢，导致相应浓度的TG和TC水平升高。我们的研究结果表明，PFHxS在分子水平上破坏斑马鱼的肝脏脂质代谢，可能影响脂滴，从而促进肝脏脂肪变性。一个值得关注的关键问题是，脂肪肝疾病的主要病理标志是大泡性肝脂肪变性，其特征是肝细胞中大脂滴的积聚。这表明PFHxS可能通过促进肝脏内的脂质积聚而参与脂肪肝疾病的发病机制。

Tg（ApO14:GFP）转基因斑马鱼是监测肝脏形态发生全过程的理想模型。形态学上，转基因Tg（Apo14:GFP）斑马鱼仔鱼肝脏面积的减少表明PFHxS影响肝脏发育。Fabp10a是一种肝细胞特异性标志物，在调节脂质摄取和转运中起着关键作用，是斑马鱼肝脏发育的可靠指标。暴露于0.01μg/L PFHxS后，fabp10a的显著下调，再加上相对肝脏大小的减小和肝组织损伤的加重，强烈表明PFHxS导致肝脏发育受损。肝脂肪变性不仅会导致脂质积聚，还会导致炎症、纤维化和肝酶升高，并伴随着脂质过度积聚导致的空泡形成。暴露于PFAS可诱导成年斑马鱼和小鼠的肝肿大和肝空泡化。在本研究中，斑马鱼肝脏出现空泡化和肝细胞变性，这表明PFHxS暴露后肝脂肪变性可能导致肝损伤。ALT和AST是用于评估肝细胞损伤的两种标志性转氨酶，与肝纤维化的发展密切相关。先前的研究表明，PFOA会诱导罗非鱼的肝毒性，导致AST和ALT水平升高。同样，暴露于PFHxS的斑马鱼的AST和ALT活性在1μg/L时显著升高。随后，暴露于1μg/L PFHxS后，tgfb1a的表达也显著上调，这与AST和ALT的活性增加是一致的。tgfb1a参与肝纤维化，其上调表明肝损伤。某些肝脏生化标志物和基因表达变化显示出不一致的模式。这可能是由于随着暴露水平的增加，肝损伤相关酶（AST、ALT）和纤维化相关基因（tgfb1a）的表达普遍增加，而脂质分解代谢基因（acox1、pnpla2、cpt1aa）的表达减少。这表明，抑制脂质分解代谢会促进脂质积累，最终导致TC和TG水平升高。在生化测量中，与对照组相比，所有暴露组均呈总体上升趋势。对于基因表达，脂质代谢和肝脏发育基因在不同暴露浓度下通常下调，而肝纤维化基因上调。值得注意的是，0.1和1μg/L组在基因表达和生化参数方面表现出一致的调控模式。

越来越多的证据表明，PPAR信号通路在调节肝脏的脂质代谢、葡萄糖代谢和炎症反应中起着关键作用。先前的研究表明，PFHxS可以通过PPAR信号通路诱导斑马鱼的脂质失调。然而，其在介导肝毒性中的作用尚未得到最终证实。在利用转录组学分析对PPAR介导的肝毒性反应进行全面评估的同时，对所涉及的分子机制进行了表征。通过分子建模、拮抗剂测定和敲除实验调节PPAR途径中的基因表达，证实PPAR在肝毒性中的作用，PFHxS通过氢键和卤素键与其稳定结合。研究人员发现，PFAS可以与PPAR受体结合，干扰肝脏中的脂质代谢过程。据报道，两种PPAR拮抗剂（GW6471和SR9243）缓解了高脂饮食诱导的小鼠TG升高。同时，PFHxS与GW6471和PPAR吗啉代的共同暴露显著减轻了AST、ALT、TC和TG水平的升高，进一步证明PFAS诱导的肝毒性是通过PPAR信号通路介导的。然而，应该指出的是，无论是PPAR吗啉代还是PPAR抑制剂都不能完全消除PFHxS的肝毒性，这表明PFHxS除了PPAR激活外，还可能通过其他途径影响肝功能，如固醇调节元件结合蛋白（SREBP）途径，尽管需要进一步的研究来验证这一机制。

暴露于PFHxS后，PPAR介导的过程，包括葡萄糖代谢、胆固醇代谢和脂肪酸转运，被破坏，导致AST、ALT、TC和TG水平等肝功能指标的改变。这些肝功能标志物和基因表达谱被进一步概念化，以更好地证明这种关系。PFHxS暴露引发了肝功能基因和生化标志物之间的复杂相互作用，最终导致斑马鱼肝功能障碍。值得注意的是，在1μg/L PFHxS时，纤维化相关基因tgfb1a的显著上调，以及肝损伤标志物AST和ALT水平的升高，进一步突显了肝损伤的发生。脂质分解代谢基因包括pnpla2、acox1和cpt1aa的下调有助于TC和TG的积累。TC的关键成分HDL-C和LDL-C的同时升高加剧了TC的积累。此外，AST和ALT与葡萄糖代谢途径中的乙酰辅酶A密切相关，其水平的改变可能会影响乙酰辅酶A浓度，从而可能导致TC和TG的进一步积累，从而加重肝损伤并促进脂肪肝疾病的进展。PPAR调节的胆固醇代谢基因（cyp27a和cyp8b1）在1和10μg/L PFHxS时显著下调，可能通过损害TC转化为胆汁酸来促进TC积累。另一方面，在相同的PFHxS暴露浓度下，PPAR调节的脂质转运基因apoa1a的上调可能在促进细胞内脂质清除、部分补偿肝脏脂质积聚和导致TG水平升高方面发挥作用。

总之，PFHxS已被广泛使用，可对野生动物、鱼类和人类产生广泛的有害影响。本研究探讨了PFHxS对斑马鱼幼虫的肝毒性，阐明了其潜在的分子机制，从而为评估PFHxS带来的生态风险提供了关键资源。尽管一些地区提出了监管PFHxS排放的建议，但许多国家仍然缺乏控制其排放的监管措施。在某些国家，PFHxS的使用在工业实践中被特别豁免，这可能会导致PFHxS持续释放到环境中。在未来的实践中，确定更安全、更可靠的PFAS替代品，控制PFHxS的消费可能是有益的。因此，有必要进一步研究以更好地了解PFHxS易感性的潜在长期环境影响。