今天分享的是2024年7月发表在J. Am. Chem. Soc.上题为Phase Separation Modulates the Thermodynamics and Kinetics of RNA Hybridization的文章.
本文的通讯作者是来自多伦多大学化学系的Lewis E. Kay教授和Atul K. Rangadurai博士，其研究方向为超分子机器的核磁表征、低丰度蛋白构象的测定等。
在方法学上，液体核磁共振波谱（NMR）技术可以为液态凝聚物中的RNA分子提供原子级别分辨率的结构信息。向RNA引入2′-甲氧基修饰，可以在不影响RNA碱基配对的情况下通过甲基横向弛豫优化谱探测RNA结构的热力学和动力学行为。
因此，本文以在RNA加工和翻译调控中起重要作用的CARPIN1蛋白和双链RNA形成的凝聚物为模型，建立核磁实验方法以表征凝聚物中RNA的热力学和动力学性质。
作者向RNA双链上的一个G核苷酸引入13C标记的2′-甲氧基修饰（图1A），将其与CAPRIN1蛋白混合发生相分离之后，把稀相（dilute phase）和浓缩相（condensed phase）一同转移至3 mm核磁管中。此时仅有浓缩相覆盖核磁射频线圈，因此在核磁实验中检测的信号全部来自于凝聚物（图1B）。作者利用脉冲梯度场采集13C-1H ddHMQC相关谱，归属来自双链RNA和单链RNA的信号，并发现溶液中双链RNA占主要比例，而凝聚物中单链RNA占主要比例（图1C）。他们监测了溶液和凝聚物状态中单链RNA比例随温度的变化（图1D），发现在65 °C时凝聚物中的双链完全解离，而溶液中仅有<5%的双链解离为单链，这说明双链RNA的热力学稳定性在凝聚物中较溶液状态下更低。作者进一步利用脉冲梯度场核磁测定了凝聚物中单链RNA和CAPRIN1蛋白的平动扩散速率（图1E），发现单链RNA在溶液中的扩散速率是其在凝聚物中的~30倍。
为了探索凝聚物中RNA双链去热力学稳定性的动力学基础，作者在不同的交换时间(exchange time, T)采集磁化交换谱，测定双链形成的kon和koff（图2A）。他们调整了核磁实验中exchange block和13C evolution脉冲序列的顺序，以提高单链和双链RNA中2′-甲氧基13C信号的分辨率。通过拟合对角峰强度随时间变化的曲线，作者得到凝聚物中RNA双链杂交的kon和koff 分别为810 ± 120 M−1 s−1 和 2.9 ± 0.4 s−1，而溶液中的的kon和koff分别为(2.2 ± 0.5) × 105 M−1 s−1 和 0.2 ± 0.1 s−1（图2B），表明凝聚物中高浓度CAPRIN1的存在将kon降低了~270倍和将koff提高了~15倍。考虑到先前测得凝聚物中单链RNA扩散效率降低30倍，kon降低的剩下9倍可能来自CAPRIN1对单链RNA的结合，即单链RNA需要先从CAPRIN1解离才能杂交形成双链。相似地，koff 提高地15倍则可能是CAPRIN1对单链RNA的捕获促进了双链的解离，阻碍了解离后的单链重新形成双链（图2D）。
本工作发展了基于NMR技术表征凝聚物中RNA热力学和动力学性质的方法，揭示了在RNA-蛋白凝聚物中蛋白作为溶剂调控核酸分子识别的机制。
撰稿：万里祺
校对：郭沛
编辑：侯佳宁
