今天分享一篇2024年7月发表在Journal of Nanobiotechnology上的文章，题目是Targeted delivery of CEBPA-saRNA for the treatment of pancreatic ductal adenocarcinoma by transferrin receptor aptamer decorated tetrahedral framework nucleic acid。通讯作者是朱长峰教授（复旦大学附属中山医院消化内科），主要研究方向包括纳米材料、生物传感器等。
胰腺癌是全球最致命的恶性肿瘤之一，其中胰腺导管腺癌（PDAC）占其发病率的85%以上。胰腺癌因遗传不稳定、代谢失调、免疫抑制、血管不足的存在，从而对传统的放疗和化疗产生耐药性。因此，大多数胰腺癌患者无法从新兴的新药物和疗法中受益，突显了迫切需要探索针对这种恶性肿瘤的创新治疗方法的需求。本研究开发了一种tTR14修饰的tFNA纳米载体，将靶向CEBPA基因的外源性saRNA (CEBPA-saRNA)特异性递送至胰腺癌细胞，激活肿瘤抑制因子CEBPA及其下游效应物，抑制肿瘤细胞增殖。
作者设计了一个基于tFNA作为构建块。tFNA纳米载体中，S2L和S3L链各自具有额外的5'粘性突起，这些突起与saRNA有效载荷的棒状5'末端和目标识别适体序列杂交，最终形成以hTfR适体装饰并携带CEBPA靶向saRNA的三维纳米结构。作者使用非变性胶和透射电镜证实了这些tFNAs的成功合成，。为了表征这些纳米结构，作者还使用用了粒径电位器来测定它们的表观zeta电位，并使用动态光散射来评估aptFNAsa的水合粒径。
作者评估了不同tFNA结构掺入后tFNAsa和aptFNAsa在血清中的稳定性。结果表明：在48小时血清孵育后，tFNAsa和aptFNAsa仍能保持其初始数量的50%以上（图2A）。此外，作者检测了DNA纳米结构在不同pH条件下的稳定性（图2B）。随后使用PAGE分析了各种纳米材料与PANC-1细胞裂解物孵育0、6、12、 24或48小时的稳定性。结果显示，纳米结构在48小时内表现出部分稳定性（图2C）。作者使用RNase H模拟细胞内条件并评估aptFNAsa的saRNA释放能力，发现随着RNase H浓度的升高，tFNA纳米载体上的saRNA释放量逐渐增加（图2D、2E）。
TR14适体针对人类转铁蛋白受体(hTfR)，并证实TR14适体通过网格蛋白介导的内吞作用进入细胞。实验结果与这些研究一致，引入四面体结构后，Cy3-tFNA、Cy3-tFNAns和Cy3-aptFNAns显示明显红色荧光（图3A）。流式细胞术分析显示，Cy3-aptFNAns的相对荧光强度高于其他两组(图3B、C)，这表明tTR14适体有助于增加Cy3-aptFNAns的细胞摄取。在初步研究后，我们评估了含tFNA、tFNAns和aptFNAns的PANC-1细胞的细胞毒性。结果显示，150 nM浓度下，这些药物对细胞无明显毒性（图3D）。进一步研究了aptFNAns对PANC-1细胞的影响，发现不同浓度（50、100、150 nM）处理48小时后，细胞活力与未处理细胞无显著差异（图3E）。免疫荧光染色结果表明，aptFNAns处理后，PANC-1细胞维持典型结构并有明显增殖。这些发现确认了DNA四面体材料的有效细胞摄取、生物相容性和无毒性。
在体外评估tFNAs纳米载体对saRNA的基因激活作用，通过RT-qPCR和Western blot检测CEBPA及其下游基因P21的转录和蛋白水平（图 4A-D），结果显示，aptFNAsa (150 nM)处理的细胞中相较于未处理细胞，与tFNAsa (150 nM)和Lipofectamine转染的细胞相比，aptFNAsa显示出更强的CEBPA和P21激活。利用MTT和EdU法评估了各组对PANC-1细胞增殖的影响（图4E）。MTT结果显示，aptFNAsa (150 nM)显著抑制了PANC-1细胞的增殖，72 h后细胞存活率仅为未处理细胞的一半。aptFNAsa组的EdU明显低于其他组，表明aptFNAsa明显抑制了PANC-1细胞的增殖(图4F)。
通过皮下注射PANC-1细胞到裸鼠腋窝建立了异种移植肿瘤模型（图5A）,在21天的观察期结束时，接受PBS治疗的队列显示肿瘤的平均重量和体积均显著增加。相比之下，接受aptFNAsa或tFNAsa治疗的小鼠肿瘤尺寸和质量明显下降(图5B和D)。这证实了saRNA 引导的CEBPA具有强大的肿瘤抑制能力。采用qPCR检测CEBPA和P21基因的转录组结构。由此得出的数据表明，在aptfnasa处理的队列中，这两个基因的转录水平显著增加(图5E和F)。同样，从各种肿瘤细胞组中提取蛋白质来分析CEBPA和P21的表达水平。aptFNAsa治疗组CEBPA和P21的表达显著上调(图5G和H)。这些发现支持aptFNAsa通过激活CEBPA和P21基因，在小鼠体内减轻PDAC肿瘤的增殖作用，证明其有效的体内抗肿瘤活性。
作者利用基因治疗的潜力克服PDAC治疗带来的障碍。通过探索利用tFNA作为载体和hTfR核酸适体作为靶向配体，成功构建了基于saRNA的CEBPA配方，以激活肿瘤抑制因子CEBPA来治疗这种具有挑战性的癌症。
撰稿：刘洋
校对：彭瑞资
编辑：侯佳宁
