今天分享的是近期发表在Nature Nanotechnology上的一篇文章，题目为Amodular DNA origami nanocompartment for engineering a cell-free, protein unfolding and degradation pathway。本文的通讯作者是来德国杜伊斯堡-埃森大学B. Saccà和H. Meyer教授，该课题组的主要研究方向为基于DNA纳米技术分级结构、空间限域和动态响应来构建复杂生物系统的简化模型。
细胞内部的化学反应通过模块化结构得到有序的控制。例如，蛋白酶体这类模块化酶，通过其特定的催化结构域顺序处理底物，实现复杂功能。受自然界这些精密机器的启发，科学家们已在细胞内外环境中成功构建了人造生物学隔室，用以重建和调控代谢途径。尽管多数系统依赖于蛋白质和脂质的周期性自组装，但利用DNA折纸技术，可以创建具有精确空间坐标的可编程3D结构，并在亚纳米级精度上对表面进行功能化。此外，已有研究开发了模块化组装程序，使得多个结构能有序地组合成大型微米级组件。这些技术被用来研究空间限制和分子间距对酶活性的影响。尽管如此，要模拟天然模块化酶的复杂性，控制多个反应的顺序仍是当前面临的重要挑战。
作者利用DNA的可编程性，设计了一种具有多催化功能的模块化和分区结构。他们创造了一个半合成的26S蛋白酶体原型，通过人工嵌合体将蛋白质的分离和展开与后续的水解反应相结合。这种设计通过精确控制展开机器的化学计量、空间布局和方向，实现了对底物进入、展开和加工到下游蛋白水解模块的特定入口机制。空间限制提高了每个催化步骤的效率，而模块间的物理连接增强了整个级联的性能，并减少了非目标相互作用。此外，通过调整下游模块的活性，嵌合体可以被重新编程以执行不同的功能，这表明了该方法在工程特定底物的生物催化途径方面的潜力。
作者设计了一种模块化嵌合体，以p97和α胰凝乳蛋白酶（aCt）分别作为其催化链的首尾反应。p97由两个六聚体环组成，中心形成一窄通道，其N端结构域与D1环相连，而C端尾部则连接到D2环。在细胞内，p97负责招募泛素化底物蛋白，促进其在蛋白酶体中的降解，或以非泛素依赖方式靶向底物蛋白进行再循环，两者均依赖于特定的衔接蛋白和相同的展开机制。ATP水解推动底物蛋白通过D1孔，穿越通道，最终从D2孔排出。为了模拟这一过程，作者在体外重建了一个不依赖泛素的分离和展开途径，作为模型的上游反应。I3底物与辅因子PP1和SDS22形成的SP-I3复合物，通过适配蛋白p37被直接招募到p97。加入ATP后，I3底物展开并分离。为了有效结合底物展开与蛋白水解，p97需要与aCt物理上接近但又保持分离，以避免非目标蛋白的水解（图1）。
作者创造了一个六角形中空棱柱状的DNA折纸隔室，尺寸为25纳米×41纳米×53纳米，由两个相同的半部（N和E）组成，通过互补的边缘碱基配对连接。这个隔室的尺寸与p97相匹配，留有足够的空间以确保p97能与蛋白质伴侣结合，并自由进行机械运动。此外，通过对NE的边缘进行挤压和侵入的修饰，隔室的末端可以连接一个或两个DNA折纸盖，或者沿纵轴连接两个或三个NE结构单元，形成线性多室结构，实现了模块化设计（图2）。
作者将带有Halo Tag的亚基基因与p97的C端融合，并与氯己烷修饰的DNA共价结合。AGE实验证实了p97与DNA折纸仅在存在PA handle时才能成功连接。通过透射电子显微镜（TEM）观察，确认了纯化的DNA折纸蛋白复合物的形成。TEM图像显示，p97在隔室一端呈椭圆形，其长轴与隔室孔径平行，表明蛋白质正确地定位在隔室内，且其孔与DNA轴线对齐。理论上，p97蛋白相对于DNA隔室有两种可能的取向：一种是N端结构域朝向隔室内部（N-in），另一种是朝向外部（N-out）。三维冷冻电镜（cryo-EM）的密度图揭示了一个不对称的蛋白质信号与DNA室的中轴线同轴排列，大部分信号集中在一侧，其中大部分信号（主要来自D1环和外周N结构域）靠近隔室孔。p97与DNA室的中轴线对齐，尽管显示出一定的流动性，但主要位于隔室的一端，较大的N端亚基朝向外部（图3）。
为了深入了解区隔化对p97活性的影响，研究者比较了不同设计的DNA隔室对p97活性的作用。研究发现，将p97限制在DNA隔室内可以最大化其酶活性。特别是，当A(p97)构建体在两个入口处配备了不同孔径的盖子时，底物展开的速率得到了提升，尤其是AL4(p97)，它在p97的上游区域具有一个受限空间。这种空间限制不仅加快了底物展开的速度，而且与隔室的大小密切相关，尤其是在p97的上游区域。与其它DNA支架酶系统相似，空间限制可能通过促进结合蛋白的构象稳定性或增加局部底物浓度来提高反应速率（图4）。
将荧光标记和巯基修饰的单链DNA与aCt共价连接后，aCt的KM值增加约1.5倍，而B(aCt)的Kcat速率比未结合的aCt快5倍。当存在6PAs时，反应速度提高至13倍，表明固定在DNA腔室中可显著提升酶的催化效率。凝胶电泳分析显示，由于其内在无序构象，SP-I3mEos复合物的I3部分被迅速且几乎完全降解。
作者将A(p97)分离和展开模块与B(aCt)蛋白水解模块连接，构建了A(p97)/B(aCt)模组化嵌合体，重建了底物展开和降解途径。AGE和TEM分析证实了单个模块的成功构建和嵌合体的产率，其中40%的结构在预期位置含有p97蛋白。在ATP加入后，A(p97)/B(aCt)结构中荧光信号立即损失约10%，而单个模块混合物无明显变化，验证了模组化嵌合体的展开活性。质谱分析表明，将aCt模块连接在p97模块下游，几乎使I3mEos的降解效率提高一倍。AGE观察到固定在隔室内的aCt能保护蛋白酶免受自身蛋白水解（图5）。
通过DNA折纸技术，研究者设计了一种模块化酶，它能够精准识别、展开并消化特定底物，实现了化学计量的精确控制、空间布局的有序排列和反应方向的单向性。这种空间限制使单个反应速率提升了10倍，而将酶物理连接成嵌合体，有效耦合了两个反应步骤，减少了近6倍的非目标蛋白水解。此外，模块化策略为嵌合体引入更多结构和功能特性（例如刺激响应模块）提供了可能，从而扩展了其功能性。
撰稿：党阳
校对：何磊
编辑：江言
