今天给大家分享一篇2024年5月发表在Science上题为“Demixing is a default process for biological condensates formed via phase separation”的文章。通讯作者是南方科技大学的张明杰教授，课题组研究方向主要集中在突触形成和可塑性的机理基础上。在本工作中，研究者以兴奋性突触后致密区（ePSD）及抑制性突触后致密区（iPSD）为对象，阐述了细胞内的无膜细胞器如何在细胞内保持相互分离的机制。
突触是高度区室化、自我组装的亚微米尺度的微反应器。区室中的蛋白组分决定突触的性质，如兴奋性或抑制性。以兴奋性突触为例，每个突触都包含一层蛋白质高度聚集的区域，称为突触后致密区（postsynaptic density，PSD）负责大脑信号的处理和传递。PSD蛋白编码基因突变是导致自闭症、精神分裂症和智障等精神疾病的主要原因。
研究表明，神经系统中兴奋性和抑制性突触可以同时在一个树突棘上形成，这种特化的结构被称为Dually innervated Spine (DiS)。在DiS中，兴奋性突触后致密区（ePSD）与抑制性突触后致密区（iPSD）同时存在于一个微米级别尺寸的突触后膜区域，却不会互相融合，但机制尚不清晰。本文探索了突触中ePSD和iPSD不互融的机制，为理解生物大分子在细胞内的功能以及发展靶向生物凝聚体的策略提供新的视角。
研究人员首先在体外建立同时包含ePSD与iPSD的DiS体系，发现将纯化的ePSD和iPSD支架蛋白混合后，可以自发地形成两种空间分离的凝聚体（图1 A-B）。在兴奋性信号传递过程中，PSD-95蛋白与Stg_CT受体蛋白特异性结合发挥关键作用。研究表明，当混入Stg_CT蛋白后，其可被特异性募集至ePSD凝聚物中。然而，将Stg_CT突变为Stg_d4后，显著降低其在ePSD凝聚物中的富集程度，反而在iPSD中富集（图1 C-D）。与此类似，当其他PSD蛋白（如GPHN-E与Hamer-3）突变后，不能观察到iPSD与ePSD凝聚物的分离（图1 E）。接下来，为了更精确模拟DiS体系，研究人员将4×iPSD与5×ePSD混合。与先前结果一致，iPSD凝聚物与ePSD凝聚物分离（图1 F）。因此，研究者认为ePSD与iPSD形成区室化的凝聚物，这与凝聚物分子间相分离能力及特异性相互作用有关。
接下来，研究人员在巨型单层囊泡中进一步探究能否观察到ePSD与iPSD分离的现象。他们将ePSD受体蛋白Stg_CT或iPSD受体蛋白GlyR-βLD分别锚定到巨型囊泡表面,加入ePSD和iPSD支架蛋白后，观察凝聚体的形成和分隔情况。结果表明，没有支架蛋白时，GlyR-βLD或Stg_CT在囊泡表面均匀分布（图2 B）。将GPHN-E蛋白加入含有GlyR-βLD受体蛋白修饰的囊泡中，囊泡表面形成与GlyR-βLD蛋白共定位的团簇，同时这些团簇表现为不规则的形状。同样地，将ePSD支架蛋白加入含有修饰Stg_CT受体蛋白的囊泡时，导致囊泡表面形成ePSD凝聚物（图2 C-D）。当囊泡表面同时修饰Stg_CT与GlyR-βLD时，发现Stg_CT与GlyR-βLD在膜表面均匀分布。加入支架蛋白后，形成区域化的ePSD与iPSD凝聚物（图2 E-H）。接下来，研究者通过广场及SIM显微镜成像表明巨型囊泡表面的ePSD和iPSD凝聚物具有明显的分区，且两种类型的PSD具有共同的稀相（图2 I）。
为了进一步观察巨型囊泡中相的分布，研究人员开发了具有更高分辨率的成像系统HILO（highly inclined and laminated optical sheet）去观察凝聚物的组成。与前先研究结果一致，PSD凝聚物在巨型囊泡表面相分离（图3 A-B）。随后，研究人员通过单分子技术进一步观察e/iPSD凝聚物能否捕获膜表面受体。当未加入PSD支架蛋白时，Stg_CT与GlyR-βLD在膜表面自由分布。形成PSD凝聚物后，Stg_CT与GlyR-βLD被富集至凝聚物且分子扩散速率降低，表明Stg_CT与GlyR-βLD被募集至凝聚物中。因此，单分子失踪实验进一步表明Stg_CT和GlyR-βLD在移动状态和受限状态之间切换，暗示在PSD凝聚物中percolated network的形成（图3 C-F）。
接下来，研究人员进一步在细胞内构建e/iPSD凝聚物。他们以Hela细胞作为模型，共转染表达ePSD及iPSD支架蛋白的质粒后，在细胞内观察到两种独立的液滴，表明e/iPSD凝聚物的形成，同时细胞内e/iPSD凝聚物是区室化的。此外，研究人员发现细胞中仅存在ePSD间或iPSD间凝聚物的融合，而ePSD凝聚物不能与iPSD凝聚物相融合（图3 G-J）。因此，在活细胞中ePSD与iPSD凝聚物也是被隔离的。
研究人员进一步探究驱动e/iPSD 凝聚物区室化的分子机制。为了衡量两种凝聚体之间分离的能力，研究人员尝试引入桥梁蛋白来诱导e/iPSD凝聚体的混合。PSD-95.FingR是一种与PSD-95支架蛋白特异结合的细胞内抗体（图4 A）。研究人间将GPHN与和PSD-95.FingR连接，形成GPHN-290E-95FR复合物（图4 B-C）。结果表明，GPHN-290E-95FR的引入导致PSD蛋白的错误定位，如PSD-95可以被富集至GPHN-290E凝聚物中；GPHN-E可以被富集到含有PSD-95凝聚物中（图4 D-E）。随后，研究人员通过调节体系中PSD支架蛋白，使得GPHN-290E-95FR克服与PSD-95分子间一对一的强相互作用，将ePSD与iPSD凝聚物分（图F-K）。
最后，研究者在神经细胞模型中进一步研究e/iPSD凝聚物。生理情况下，e/iPSD凝聚物在空间上相分离。然而，与体外实验相一致，过表达的GPHN-95FR会被错误募集至ePSD中（图5 A-B）。此外，GABAARγ2是iPSD的受体蛋白，当细胞内过表达GPHN-95FR后，抑制了GPHN与GABAARγ2共定位。受到先前研究的启发，研究人员在细胞中过表达iPSD支架蛋白增加iPSD网络的复杂性，使GPHN-95FR与PSD-95分离，挽救了GPHN-95FR的错误定位（图5 C）。通过dSTORM的超分辨成像方法，进一步分析细胞中凝聚物的共定位情况。dSTORM成像显示GPHN-95FR与ePSD支架蛋白存在共定位，表达CB蛋白后减少了GPHN-95FR与ePSD支架蛋白共定位的面积，这表明GPHN-95FR被部分募集到ePSD中，CB蛋白的加入挽救了GPHN-95FR的错误定位（图5 D-E）。
该工作以突触中ePSD及iPSD为研究对象，揭示了e/iPSD存在于同一个突触后膜区域而不互融的机制。该机制不同于我们已知的在稀溶液中总是由单分子间的相互作用强度决定分子定位的模式，而关键在于发生相分离的同时形成了percolated network。这种机制对理解细胞内不同的无膜细胞器间的区室化起到了重要作用。
撰稿：刘玉
校对：郭沛
编辑：侯佳宁
