大家好，今天给大家分享的这篇文章是2024年4月发表在Advanced Science上的，题目为YY2/BUB3 Axis promotes SAC Hyperactivation and Inhibits Colorectal Cancer Progression via Regulating Chromosomal Instability，通讯作者为重庆大学江启慧教授，其研究方向肿瘤细胞周期调控分子机制，肿瘤基因组不稳定性。
染色体不稳定性（chromosomal instability -CIN）的特征是由于异常分离导致染色体结构和数值异常的发生率增加。CIN是公认的癌症标志，≈90%的肿瘤表现出复杂的核型。此外，CIN可以促进肿瘤的发生，并与耐药性和不良生存结果有关。而过高水平的CIN与肿瘤患者预后改善呈正相关。
纺锤体组装检查点（spindle assembly checkpoint-SAC）是主要的细胞周期检查点之一，其活性受损是CIN的主要原因。作为中期-后期过渡点的检查点，它确保姐妹染色单体平均分离到两个后代细胞中。在所有姐妹染色单体排列在赤道并附着于纺锤体微管之前，SAC缺陷会触发过早的姐妹染色单体分离和有丝分裂退出。SAC过度激活也会诱导CIN，SAC过度激活在肿瘤发生中的作用仍然知之甚少。
作者为鉴定一种新的SAC调节剂，从数据库筛选到与“有丝分裂姐妹染色单体分离”和“有丝分裂纺锤体组装检查点信号”相关的基因，在排除与入组后，又经过转录因子（transcription factor-TF）富集分析（1A）。前17个TF中，8个TF是已知的SAC调节剂，9个TF是潜在的新型SAC调节剂(1B)。因调节细胞周期的TF在细胞周期进程中表现出振荡。在血清饥饿释放24 h后，Qpcr示ZFP69等8个TF在细胞周期中无显著差异，而YY2 mRNA的表达明显增加并在M期达到峰值(1C)。其蛋白水平在饥饿释放后16 h开始增加并在24 h达到峰值(1D)。有丝分裂测量显示YY2过表达将有丝分裂时间从53.6 min延长至73.7 min，YY2KO将有丝分裂时间从52.8 min显著缩短至42.8 min(1G,H)。YY2过表达导致SAC活性增强 (1I)，YY2基因敲除作用则相反(1J)。
据报道YY2具有肿瘤抑制功能，作者为进一步研究YY2调节SAC活性与肿瘤增殖的关系，发现YY2过表达可增加HCT116细胞死亡率(2A)。而YY2KO并没有显著影响细胞死亡率(2B)。为研究YY2是否通过调节SAC活性发挥其肿瘤抑制作用，用SAC活性抑制剂reversine处理YY2过表达细胞。reversine处理缩短了YY2过表达延长的有丝分裂时间，从72.7 min至52.9 min，与对照组相似(2C)。表明reversine处理将YY2诱导的SAC过度激活恢复到与对照组相似的水平。reversine处理增加了对照细胞的死亡率，而抑制了YY2过表达细胞的死亡率(2D)。结果提示适当水平的SAC活性对细胞存活至关重要且YY2介导的SAC激活和有丝分裂调节是发挥其肿瘤抑制作用的关键。
为分析YY2介导的SAC活性调控的分子机制，进行跨组学分析确定其潜在的转录靶点。RNA-seq分析YY2过表达细胞（3A)。GO分析示YY2过表达富集了参与姐妹染色单体分裂的相关基因 (3B，C)。为鉴定YY2转录靶点。将RNA-seq与ChIP测序及GO筛选重叠，BUB3和TEX14为YY2潜在的转录靶点(3D)。BUB3是有丝分裂进程的SAC复合体的组成部分，TEX14睾丸组织特异性。YY2KO及过表达的细胞中，BUB3蛋白表达与YY2呈正相关(3E)。JASPAR分析发现在BUB3启动子区域的-684至-675处发现潜在的YY2结合位点(3F)。为证实该作用，构建了BUB3启动子的BUB3- luc -1、2、3、4、5载体(3F)。YY2KO显著抑制Luc-1、2、3和4的转录活性，YY2过表达促进Luc-1、2、3和4转录活性，但对Luc-5无作用(3G,H)。表明BUB3启动子的-723至659区对YY2介导的BUB3转录活性调控至关重要。ChIP显示YY2可以结合到BUB3启动子的-721至-589区(3I)。表明YY2是BUB3的转录因子，证实YY2通过增强BUB3表达调控SAC，进而调控有丝分裂进程和致瘤潜能。
SAC活性缺陷破坏了其保证染色体正常分裂的机制。作者检测了YY2KO对CIN指标的影响。发现HCT 116 YY2KO细胞中，>4N的细胞数显著增加（4A），细胞核大小增加（4B）。中期核型示与对照组相比YY2KO细胞47条以上染色体的细胞百分比增加（4C）。单核型示HCT116YY2KO核型异质性增加 (4D)。YY2KO增加了染色体桥接率(4E)，增加微核率(4F)。提示YY2/BUB3通路缺陷可能有助于细胞中CIN诱导，可能原因是SAC活性受损。YY2过表达导致SAC过度活化和有丝分裂延迟，增加了多倍体细胞 (4G-L)。表明YY2过表达可能增加CIN。
YY2KO和过表达都可诱导CIN。临床研究表明高CIN患者预后较好。使用TCGA CRC数据集，对一线CRC奥沙利铂治疗的患者无复发生存率与CIN70水平进行相关性分析，CIN70已被确定为CIN的替代品。中度CIN水平与预后不良相关，高度CIN与预后好相关 (5A)。为控制YY2过表达时间，建立Tet-On YY2过表达系统。诱导YY2过表达后，细胞死亡率呈时间依赖性增加(5B)，reversine治疗使其消失(5C)，提示YY2过表达诱导的SAC过度活化与细胞死亡之间相关。表明YY2诱导的细胞死亡可能与SAC过度激活诱导的CIN有关。微核率在多西环素处理72h下降，表明高CIN细胞难以存活(5D)。为研究CIN水平与细胞死亡关系，用PI对细胞染色，对死亡细胞和活细胞(5E)进行分类。死亡YY2过表达细胞中微核率高于活YY2过度表达细胞（5F）。对照细胞中，多倍体细胞的比例没有显著差异，而在YY2过表达的死亡的HCT116细胞中，多倍体细胞比例显著高于活细胞(5G)。虽在未处理的HCT116YY2KO细胞中只有少量死亡细胞，但证实这些细胞中的微核率和多倍体细胞百分比明显高于活的HCT116YY2KO细胞(5H-J)。
中度CIN水平与预后不良相关，提出了关于这些中度CIN细胞特征问题。在活细胞分选后停用多西环素-DOX来逆转YY2过表达（TetOn-YY2 Trans细胞）以避免持续SAC激活。停用DOX 2天CIN指标保持轻微升高，主要体现在中期染色体Spread，染色体桥，微核CIN水平方面 (6A-E)。TetOnYY2 Trans活力与对照相似的水平 (6F,G)。而在奥沙利铂诱导的dna损伤下，TetOn-YY2 Trans细胞表现出更高活力(6H, 1)。TetOn-YY2 Trans细胞的细胞死亡率明显低于CIN阴性细胞(6J)，提示奥沙利铂治疗前的CIN水平导致了持续和短暂过表达YY2细胞的生存能力差异。残留细胞在抗肿瘤药物治疗后存活下来，可作为肿瘤耐药复发的关键。YY2诱导SAC过度活化的活细胞具有中度CIN，中度CIN可能也参与了DNA损伤诱导剂治疗后残留肿瘤细胞的耐药。为测试这种可能性,通过分选奥沙利铂治疗后存活的细胞，从感染TetOn-YY2慢病毒的细胞中获得残余肿瘤细胞，用或不用多西环素处理以诱导YY2过表达，并检查它们在奥沙利铂处理下的生存能力（6K）。微核示在未诱导YY2过表达的情况下，奥沙利铂治疗后存活的剩余细胞CIN水平中等(6L，中)，与对照组比，这些细胞表现出更好的dna损伤抗性(6M)。通过激活这些残留细胞中YY2过表达进一步诱导CIN过量(6L，右)，提高药物敏感性(6M)。表明YY2/SAC过度激活可诱导肿瘤细胞中的CIN，导致CIN过量的细胞死亡。表明在SAC过度激活或DNA损伤诱导剂治疗后幸存的残余肿瘤细胞中观察到的适度CIN对这些细胞的耐药性至关重要，而增加这些细胞的CIN可以改善它们的药物敏感性。研究结果强调CIN水平在决定肿瘤细胞存活和耐药性中的关键作用。
因YY2过表达可诱导过量的CIN，作者研究了其与奥沙利铂协同作用，因此药物可诱导CIN。YY2过表达显著降低奥沙利铂的IC50 (7A)。组合指数示，YY2过表达与奥沙利铂治疗之间存在协同效应(7B)。YY2过表达进一步增强了奥沙利铂对HCT116细胞增殖潜能的抑制作用（7C）。评估了YY2过表达诱导的过量CIN与奥沙利铂联合用于体内抗肿瘤治疗策略的可能性。利用慢病毒建立YY2过表达的稳定细胞系并进行了异种移植实验。YY2过表达与奥沙利铂联合治疗组显示出明显抑制肿瘤增殖，并明显高于YY2过表达组，奥沙利铂单药组（7D）。综上所述YY2过表达通过增加CIN使肿瘤细胞对DNA损伤诱导剂敏感，提示这种组合可能是一种潜在的抗肿瘤治疗策略。
总结：YY2是一种新的SAC调节剂，可以激活BUB3转录，从而影响SAC活性，随后通过调节CIN的水平来决定肿瘤细胞的存活和耐药性。
撰稿：王海霞
校对：汪俊彦
编辑：侯佳宁
