大家好，今天要介绍的是一篇今年在《JACS》上发表的研究。文章标题是“Functional Aptamers In Vitro Evolution for Intranuclear Blockage of RNA-Protein Interaction”。这篇研究的通讯作者是北京大学的张力勤研究员，他专注于开发多功能核酸探针、药物分析、设计新药以及探索新的药物靶点。
核酸适体是一类特殊的短核酸片段，它们能与目标分子紧密结合，常用于检测和治疗疾病。尽管科学家们一直在努力将这些适体转化为药物，但目前还没有实现让它们像抗体那样在药物开发中广泛应用的愿景。
适体筛选面临的一个主要挑战是筛选过程的效率不高。此外，为了让适体在体内发挥作用，通常需要进行复杂的修饰，这可能会削弱它们与目标的结合能力。如果筛选过程从一开始就使用包含多种官能团的文库，可能会提高找到有效适体的可能性。另一个挑战是选择合适的药物靶点。目前，适体治疗主要针对分泌蛋白或膜蛋白，这些蛋白在体内的循环系统中容易被核酸酶分解，导致快速清除。为了克服这些药代动力学和药效学的限制，需要对适体进行大量修饰，这可能会进一步影响它们与目标的结合力，限制了它们的发展。为了应对这些挑战，本研究提出了一种新的筛选方法，将亲和分子筛选与功能筛选相结合，有望快速产生具有功能的适体。这些适体不仅能与目标蛋白结合，还能调节其功能，为药物开发开辟了新的方向。
在这项研究中，研究人员开发了一个名为功能适体体外进化（FAIVE）的新平台。他们以HIV-1病毒为例，筛选出能够干扰病毒内部蛋白与TAR RNA相互作用的适配体。TAR RNA是HIV-1 RNA的一部分，它通过与病毒蛋白Tat结合，帮助病毒复制。这种RNA-蛋白质的结合促进了病毒基因的高效复制。为了找到能够阻断这种结合的适配体，研究者们设计了一个实验流程。他们首先构建了一个包含四种不同碱基的DNA文库，并通过 “点击化学”的技术，增加了文库的疏水性。他们使用TAR39 RNA序列和Tat14肽模拟了病毒内部的RNA-蛋白质相互作用。在筛选过程中，他们利用荧光标记技术来检测RNA和肽之间的相互作用。当RNA和肽结合时，荧光信号会减弱。而能够阻断这种结合的适配体则会恢复荧光信号，从而被筛选出来。通过使用荧光激活细胞分选仪（FACS）对这些适配体进行分类和扩增，研究者们不断重复这一过程，逐步筛选出能够有效阻断RNA-肽相互作用的适配体。这种方法为开发新的抗HIV-1治疗策略提供了新的可能性。
在FAIVE实验中，科学家们分别针对TAR RNA和Tat肽进行了筛选。通过两轮预富集和两轮FAIVE筛选后，测序分析一致显示功能适配体得到了有效富集，如图2所示。此外，研究者们还对TAR RNA和Tat肽进行了8轮传统的SELEX筛选。这些筛选的测序结果也一致地表明了适配体的富集。
接下来，研究者们利用高通量分析技术，深入研究了FAIVE筛选和SELEX筛选得到的前96个序列簇。他们的目标是评估这些序列簇的结合亲和力和阻断效率。通过生物层析成像（BLI）技术，他们测量了适配体与目标分子的结合强度，并采用竞争性置换分析来评估适配体的阻断能力。研究发现，与TAR RNA互补的DNA（cDNA）展现出了非常强的亲和力，达到了30 pM的级别。有趣的是，这些适配体与TAR RNA的结合并不是基于序列的互补性，而是由于它们的空间结构与TAR RNA相匹配。另一方面，针对Tat肽的适配体显示出更强的结合力，这可能是因为带正电的Tat肽与DNA适配体之间存在静电吸引。大多数筛选出的适配体的解离常数（KD）都在纳摩尔级别，这与Tat蛋白和TAR RNA之间的亲和力相当。通过SELEX筛选得到的适配体虽然结合力不错，但具有阻断功能的适配体相对较少。相比之下，FAIVE平台筛选出的适配体在阻断作用上表现更为出色，这表明FAIVE平台在开发功能性适配体方面具有巨大的潜力（如图3所示）。此外，研究还发现适配体的亲和力并不总是与它们的阻断能力直接相关，这一发现进一步证实了FAIVE筛选过程相对于传统方法的有效性。
为了测试适配体在细胞内阻断效果，研究人员采用了一种胞苷基/阳离子脂质纳米颗粒系统来将适配体送入细胞内（如图4a和4b所示）。DNCA作为一种高效的中性转染材料，能够通过氢键和π-π堆积与适配体相互作用。使用DNCA与CLD脂质体的组合，不仅减少了阳离子脂质体的使用量，降低了对细胞的毒性，还提高了适配体进入细胞的效率。研究人员利用流式细胞术来评估适配体在这些配方中的细胞摄取情况（如图4c所示），并通过动态光散射技术（DLS，如图4d所示）来测量脂质体的尺寸。此外，他们还利用共聚焦成像技术来研究这些适配体脂质体在细胞内的分布情况（如图4e所示）。
为了验证筛选出的适配体是否能够调节细胞内RNA与蛋白质的相互作用，研究人员采用了一种双荧光素酶报告基因模型系统。这个系统依赖于HIV-1的LTR启动子和TAR RNA与Tat蛋白的结合来激活转录，从而产生荧光素酶的活性，这直接反映了Tat蛋白的转录激活能力。在实验中，他们将293T细胞共转染了三种质粒：一种是含有萤火虫荧光素酶基因的报告质粒（pHIV-1-LTRLuc），用于检测转录激活；一种是含有Tat基因的效应质粒（pCEP4-tat），用于提供Tat蛋白；还有一种是含有肾素荧光素酶基因的内对照质粒（pRL-TK），用于标准化实验数据。随后，他们通过脂质体将适配体送入细胞，以评估这些适配体对Tat介导的萤火虫荧光素酶转录激活的抑制效果（如图5a所示）。研究结果显示，某些适配体的存在能够显著抑制细胞内萤火虫荧光素酶的表达，抑制效率高达70%。有趣的是，与TAR RNA结合亲和力最强的cDNA并没有显示出明显的抑制作用（如图5b所示）。这些结果表明，适配体的有效性更多地依赖于它们与目标RNA的空间结构相互作用，而不是它们的序列本身，这强调了在设计适配体时考虑目标结构特征的重要性。
接下来，研究人员进行了进一步的测试，以评估所选适配体在阻断细胞核内TAR RNA和Tat蛋白相互作用方面的有效性。他们采用了VSVG/HIV-1感染模型来检测适配体的抗HIV活性。在实验中，HEK 293T细胞被共转染了VSVG蛋白表达质粒和携带荧光素酶报告基因的缺陷型HIV载体。在VSVG/HIV-1感染12小时后，研究人员将含有适配体的优化脂质体引入这些细胞。36小时后，细胞被裂解，并通过测量荧光素酶活性来评估适配体的效果（如图6c所示）。为了提供一个参考标准，研究人员使用了已知的小分子Tat转录激活抑制剂ZL0580，并将其与DMSO（一种常用的溶剂，作为空白对照）进行了比较。在4 μM的浓度下，ZL0580能够抑制HIV-1的转录约70%，这与之前的研究结果一致，验证了实验模型的有效性。值得注意的是，测试的适配体显示出了10-40%的抑制率，并且这种抑制效果随着剂量的增加而增强，同时细胞活力保持良好。这些结果证实了适配体能够有效地阻断TAR RNA和Tat蛋白之间的相互作用（如图6d所示）。
这一成果不仅为治疗领域带来了新的希望，而且也加深了我们对核酸适体发展的理解。通过揭示核酸适体与其目标之间的复杂相互作用，本研究为适配体筛选策略提供了宝贵的见解。这不仅有助于拓宽潜在靶点的范围，也推动了药物发现的进程。
撰稿：宋明慧
校对：何磊
编辑：江言
