本次给大家分享的是2024年7月发表在Journal of the American Chemical Society上的一篇文章，题目是Controlling Drug Partitioning in Individual Protein Condensates through Laser-Induced Microscale Phase Transitions.
文章的通讯作者是乌普萨拉大学的Michael Landreh教授、Axel Leppert博士，以及瑞典农业科学大学的Anna Rising教授。Landreh教授的主要研究方向为从癌症到记忆的蛋白质相互作用的质谱；无膜细胞器中蛋白质的结构；脂质影响脂质双层中蛋白质的稳定性和功能；开发新的质谱方法等。Rising教授的主要研究方向为基于蛛丝蛋白开发新的生物医学应用，制造用于再生医学的人造蜘蛛丝纤维和水凝胶等。
通过液-液相分离形成的蛋白质凝聚物的凝胶化在自然界广泛存在，从可溶性蛋白到凝胶(溶胶-凝胶)的转变是通过宏观过程控制的，如温度或缓冲液成分的变化，导致液体液滴在几分钟到几小时内大量转化为微凝胶。此过程在蛛丝蛋白的纤维化中十分重要。
本文作者通过显微镜和质谱分析发现工程微型蜘蛛蛋白(NT2repCTYF)的凝聚体经历了自发的溶胶-凝胶转变，在己二醇存在的情况下维持分离液滴状态而不是变为均相。质谱实验表明，凝胶化转变会导致可溶相和凝聚相之间蛋白质交换的大幅度减弱。使用激光脉冲刺激可以将原本需要几小时的凝胶化过程缩短至几分钟甚至几秒钟内完成。
作者将NT2RepCTYF孵育过夜，观察到液滴大小增加，但形态与新鲜液滴相比没有变化。加入10%的1,6-己二醇后，新鲜液滴溶解，留下无定形聚集体，而孵育的液滴保持不受影响，表明凝胶的形成（图1a）。由于纺丝和凝胶化的NT2RepCT都富含β-折叠结构，作者进一步探讨凝胶化的NT2RepCTYF液滴中β-折叠的含量，结果表示孵育24h后NT2RepCTYF与染料硫磺素T（ThT）结合增强，荧光强度增高（图1b），即5分钟后ThT染色较弱表明ThT被募集到液滴中，以及24小时后均匀的强染色效果（图1c）。pFTAA染料与β折叠结构结合时表现出特定的特征性双最大发射光谱，能更好的显示液滴内β-折叠结构，结果显示出与模型淀粉样蛋白Aβ相当的双峰光谱（图1d）。对1,6-己二醇的抗性和β-片层特异性染料荧光的增加表明在凝胶化期间形成宏观动态停滞的蛛丝蛋白组装体。
基于原位质谱（nMS）分析上述假设，表明蛋白质在液滴状态时能在浓缩相和稀释相之间进行交换，而在凝胶液滴中则不进行交换。即用将15N-标记的NT2RepCTYF加入到未标记的NT 2 RepCTYF中，并用nMS测定上清液中两种蛋白质的比例。在新鲜形成的液滴中标记蛋白与未标记蛋白在两相中快速平衡，而在凝胶化液滴中仅检测到标记的蛋白质（图1e）。
作者后续探讨哪种序列特征促进蛋白质摄入NT2RepCTYF液滴。利用Atto655分别标记重组形成的各个结构域（非重复N末端NT、重复区域2Rep和非重复C末端CT），将标记的重组蛋白与未标记的NT2RepCTYF混合，并在液滴形成后使用荧光显微镜监测摄取（图2a）。发现NT最有效地掺入液滴中，其次是2Rep，而CT募集几乎检测不到（图2b）。
推测NT可能与NT2RepCTYF的游离NT结构域形成弱二聚体。为了检验这一假设，添加了Atto标记的NTD40 K/K65 D（称为NT*，不形成二聚化的变体）。发现NT* 摄取远低于野生型NT的摄取，表明NT相互作用是控制募集到蛛丝蛋白液滴中的有效方式（图2c）。
作者进一步评估凝胶化是否可以用于将NT标记的蛋白质捕获在冷凝物内，将NT2RepCTYF液滴与未标记的GFP、NT-GFP或NT*-GFP孵育，之后在37 ℃下孵育72小时以诱导凝胶化，Milli-Q洗涤三次，并再次对液滴成像。在洗涤步骤后，仅NT-GFP保留在凝胶化的液滴中（图2d）。
为了更好地理解蛛丝蛋白的亚稳定性如何影响凝胶化，作者采用荧光漂白恢复实验（FRAP），将其应用于荧光小分子ThT和DroProbe以及Atto655标记的蛋白质（图3a,b）。ThT荧光5分钟内扩散回漂白区域（图3c）。使用在405 nm处吸收非常少的粘度敏感DroProbe重复实验，DroProbe快速扩散回漂白区域，并在漂白后表现出1.5倍的过冲（图3d）。在相同条件下验证NT2RepCTYF新鲜液滴的荧光恢复情况，发现漂白区域中的Atto655荧光没有恢复，表现为凝胶状态（图3e）。综上所述，漂白区域中的蛛丝蛋白发生瞬时的溶胶-凝胶转化。
用已经凝胶化的液滴重复实验，证明凝胶时荧光恢复现象较弱。ThT和DroProb在缓慢扩散回漂白区域后没有显示荧光过冲（图3f，g），Atto655标记的NT 2 RepCTYF没有扩散回到漂白区域（图3h），表明液滴经历溶胶-凝胶转变，激光诱导的荧光过冲被削弱。
后续作者探讨在微观尺度上诱导凝胶化与小分子招募是否相关。选择在609和660 nm处具有明显的最大吸收的荧光药物Mitoxantrone，可用于治疗急性髓细胞白血病和多发性硬化症。通过监测新鲜NT2RepCTYF液滴中Mitoxantrone的荧光吸收来确认其在液滴中的募集（图4a）。光漂白恢复观察到1.5倍的荧光过冲，5分钟后增加到2倍（图4a）。使用639 nm的波长重复实验，观察到2倍的过冲荧光，随后增加到3倍。这种增加表明与周围的液滴相比，凝胶液滴对药物具有更高的亲和力。
激光诱导凝胶的最佳波长可能受到荧光药物存在的影响，并且这些药物优先招募到凝胶滴中。为了验证这一假设，选择另外两种荧光药物分子Myricetin和Riboflavin。Myricetin具有376 nm最大吸收，在405 nm激光波长下的光漂白诱导特征荧光过冲（图4b）。Riboflavin，也被称为维生素B2，具有442 nm最大吸收，几乎没有荧光过冲，445 nm处的光漂白导致荧光增加2倍（图4c）。
对于所有三种化合物，激光诱导凝胶化所需的波长与每种荧光染料的最大吸光度直接相关。推测染料作为“天线”，吸收激光能量，然后触发蛛丝凝胶化。
为探究相变中药物分布的增加是否在细胞环境中也发生，使用标记有eGFP的NT2RepCT，可以在大肠杆菌中形成细胞团。FRAP分析证实，低温和高温下形成的蜘蛛丝蛋白细胞团分别是液态和凝胶状的。在Mitoxantrone存在下，18℃或37℃表达NT2RepCT，并使用荧光显微镜评估蜘蛛丝蛋白和药物的共定位（图5a）。低温下无共定位，药物被排除在蜘蛛丝蛋白细胞团外。高温下观察到含有Mitoxantrone的eGFP-NT2RepCT组装体（图5b、c）。综上所述，37℃下形成的细胞内蜘蛛丝蛋白细胞团可重现激光诱导固溶胶-凝胶转变的关键特征。
本文发现工程微型蜘蛛蛋白(NT2repCTYF)的凝聚体经历了自发的溶胶-凝胶转变，使用激光脉冲刺激可以将原本需要几小时的凝胶化过程缩短至几分钟甚至几秒钟内完成，并且其转变可以增加细菌细胞内凝聚物的药物分配。通过激光脉冲实现对液-液相分离液滴的相变空间特异性控制，为其功能和结构表征开辟了新途径。
撰稿：高海艳
校对：郭沛
编辑：江言
