今天给大家分享的是2024年7月发表在Nature Methods上的一篇文章，题为“CRISPR-array-mediated imaging of non-repetitive and multiplex genomic loci in living cells”。本文通讯作者是来自中国科学院分子细胞科学卓越创新中心的陈玲玲教授，该课题组主要研究方向包括通过转录组测序和计算生物学手段结合的方法，发掘和鉴定人类基因组中的新类型lncRNA分子；利用分子生物学、细胞生物学和生物化学的手段，研究新lncRNA分子在基因表达调控中的作用机制；采用基因组编辑和活细胞成像等技术手段，研究lncRNA在细胞核亚结构和染色体维持以及调控过程中的功能；以hESCs的多功能潜能性维持和分化为模型，研究lncRNA对人源胚胎干细胞命运决定的调控。在本工作中，作者筛选了适用于基因组DNA成像的CRISPR-Cas12a系统，并用该系统对非重复位点进行成像，实现DNA的动态监测和基因活性预测。在结合RNA适体后，可实现对基因组DNA的多路成像。
真核生物的基因表达受到DNA的时空状态与动态相互作用的调控。目前有多种方法实现对DNA的成像，其中FISH可实现对固定细胞的可视化成像，但缺乏DNA的动态信息。活细胞成像一般依赖于融合了荧光蛋白的DNA结合蛋白，但该方法的信噪比较低。CRISPR-Cas9系统目前也大量应用于DNA成像，但靶向非重复位点时需要至少26个以上的重复，效率低下。引入局部放大手段可以提升CRISPR-Cas9对非重复位点的成像效率，但是对非靶向和脱靶的sgRNA也会有放大作用。
CRISPR-Cas12a系统属于第Ⅴ类CRISPR-Cas系统，目前研究人员在努力提高其对DNA的编辑能力，但其对DNA成像的能力并未得到测试。由于CRISPR-Cas12a可以加工CRISPR-crRNA阵列，所以可以对多路基因位点进行成像。上述特点使CRISPR-Cas12a系统有潜力对非重复位点进行多路成像。
为获得最有效的CRISPR-Cas12a DNA成像系统，作者尝试了三种工程dLbCas12a变体对人类基因组DNA中重复位点微卫星DNA（Sat）进行成像，三种变体分别为hyperdLbCas12a、LbCas12a-RR和LbCas12aRVRR（图1a，b）。通过共聚焦成像并对信噪比进行分析，筛选出hyperdLbCas12a的成像效果最好且优于WT dLbCas12a（图1c，d）。虽然高信噪比一般意味着产生更多的斑点，但是hyperdLbCas12a和WT dLbCas12a产生斑点的数量无明显差异（图1e）。通过与DNA FISH比对，证实hyperdLbCas12a产生的信号确实由Sat位点产生，且标记效率无明显差异。作者进一步引入4个突变企图进一步提升标记效率，得到三个变体denAsCas12a，hyperdAsCas12a和hyperdFnCas12a。虽然上述三个变体表现优于WT dLbCas12a，但是未优于hyperdLbCas12a，所以后续均用hyperdLbCas12a进行表征。由于CRISPR-Cas9已经广泛用于DNA成像之中，作者将hyperdLbCas12a与dSpCas9进行对比。通过比对共聚焦结果，并分析信噪比与成像效率，均说明hyperdLbCas12a优于dSpCas9（图1f-h）。
长度和特异性是CRISPR操作的重要影响因素，作者以SatⅠ为靶标，测试了4-32 nt的crRNA的成像效率（图2a）。通过共聚焦和信噪比分析，说明4 nt不能产生有效信号，长度在8-32nt之间均有SatⅠ信号，其中20-24 nt的标记效率最高（图2b，c）。
接下来，作者设计单碱基错配的20 nt crRNA靶向SatⅠ（图2d）。共聚焦和信噪比分析显示，除了前两位核苷酸以外，hyperdLbCas12a对其他位点错配的容忍度很高（图2e，f），所以可能需要多个crRNA来提升特异性。
CRISPR-Cas12a具有RNA酶活性，可特异性酶切crRNA阵列从而具有多路基因组操作活性。hyperdLbCas12a的识别位点是直接重复序列（DR），有35 nt（PreDR）。在加工过程中，5’端的15 nt会被hyperdLbCas12a去除，产生一个20 nt的成熟DR，也有一些研究使用21 nt的DR进行多路基因编辑（DR+1)。
作者设计了四个质粒，使用的均为20 nt成熟DR。在质粒Ⅰ中5’端表达DR，下游表达gSatⅠ；在Ⅱ中，gSatⅠ的上游和下游均有一个DR；Ⅲ是一个同时具有非靶向序列（gNT）和gSatⅠ的阵列，且gNT在gSatⅠ上游；Ⅳ是在Ⅲ的基础上，在gSatⅠ的下游加了一个DR（图3a）。由共聚焦和信噪比分析说明四种模式均可进行DNA成像，且成像效果无明显区别（图3b，c），说明hyperdLbCas12a可结合CRISPR-crRNA阵列进行基因组DNA成像。
然后作者以Ⅳ为基础，将其中的DR分别更换为PreDR、DR+1和DR进行进一步成像分析（图3d）。共聚焦结果和信噪比分析显示，PreDR可以对DNA进行标记，但是DR+1和DR具有更高的成像效率（图3e，f)。
在CRISPR-Cas12a的研究中，研究人员常用启动子U6表达crRNA，但相关研究中的crRNA通常短于350 nt。在CRISPR-crRNA阵列中其长度通常大于400 nt，而pU6可能难以充分转录，所以作者使用了polⅠ（prDNA）、polⅡ（pCAG、pEF1α和pCMV）和polⅢ（pU6）对不同重复个数的crRNA进行测试。在CRISPR阵列中gSatⅠ被放置在gNT的下游，因此仅在CRISPR阵列被完全转录时才会被hyperdLbCas12a酶切加工，从而产生信号（图3g）。通过共聚焦成像和信噪比分析，pU6在表达2×crRNA的时候有较高的信噪比，在表达4×时信噪比显著下降；polⅡ在表达crRNA阵列时信噪比始终很好，其中在长阵列crRNA表达中pCAG效果最好。
为简化DNA表达和标记，作者在hyperdLbCas12a-EGFP的下游插入gNT和gSatⅠ阵列，生成多顺反子转录本，并为防止转录本被外切酶降解，在3’端插入高级结构进行稳定(图4a）。由共聚焦结果和信噪比分析显示，加入稳定结构后比不加稳定结构具有更好的成像效果（图4b，c）。在hyperdLbCas12a-EGFP尾部加一个弱polyA信号产生两个转录本（图4a），并进行成像分析，发现有稳定结构的版本均可以进行成像，但是对效果没有进一步提升（图4b，c）。
作者选取长非编码RNA（lncRNA）CCAT1位点进行成像，作者设计了48×的crRNA阵列进行分析，并将其分别分为4个12×阵列、2个24×阵列、2个具有部分重叠的36×阵列和1个48×阵列进行比较（图5a，b）。通过共聚焦成像、信噪比分析和标记比例，使用12×阵列时信号不理想，当阵列大于等于24×时都可以产生明显的信号（图5c-e）。作者用DNA FISH对信号特异性进行检测，共聚焦显示二者有良好的共定位效果（图5f）。
为排除hyperdLbCas12a可能被DR阵列的转录本招募产生信号的可能，作者用smFISH靶向48×阵列的转录本。在没有hyperdLbCas12a时，阵列平均分布在细胞核和细胞质内；存在hyperdLbCas12a时，阵列仅存在于细胞核内（图5g）。qPCR结果显示，存在hyperdLbCas12a时约50%的转录本被处理为8×阵列，约30%处理为成熟crRNA。
作者在HCT116和U2OS细胞中进行成像分析，证实可以在不同细胞中进行DNA成像（图5h）。作者也选取了不同基因位点进行成像分析，证实可以对不同DNA位点进行成像（图5i）。以上结果说明hyperdLbCas12a的通用性和鲁棒性。
CARGO系统也可用于非重复位点成像，作者将CARGO和hyperdLbCas12a进行比较，说明hyperdLbCas12a系统更经济、更简单、阵列更短且质粒需要的更少（图6a，b）。后续作者将CARGO和hyperdLbCas12a进行成像比较，结果显示hyperdLbCas12a拥有更高的信噪比和成像效率（图6d-f）。作者将该系统命名为CRISPRdelight。
基因位于核外周和核内部时具有不同的转录活性。作者用SRRM2-BFP标记核内斑点，用LMNB1-RFP标记核周围。作者定义CCAT1到核外周的距离为dL，到核内斑点的距离为dS，统计结果显示dS和dL成负相关（图7a，b）。通过分析不同斑点的均方位移（MSD）曲线，核内部的CCAT1扩散明显快于靠近核外周的CCAT1基因（图7c）。由于核外周可以与基因相互作用从而抑制基因表达，所以靠近核外周的基因扩散较慢可能缘由于此（图7d）。smFISH结果显示核外周的基因表达被抑制，说明CRISPRdelight可以探测基因位点动态并探测基因分布与基因活性间的关系（图7e，f）。
在细胞应激期间，HSP有重定位和表达上升的现象。作者设计了48×crRNA阵列靶向HSP基因，共聚焦显示每个细胞可得到2-3个明显的斑点（图8a，b）。在没有应激时，HSP基因很少在核斑点附近；核热处理之后， HSP与核斑点的关联系数明显上升，砷酸盐处理也可呈现类似的效果（图8c，d）。细胞应激后，与核斑点相关的HSP基因转录水平明显上升（图8e，f）。对HSPA1A的成像中，在细胞应激后也可发现该基因与核斑点的相关系数上升，且转录水平上升（图8g，h）。
由于当下CRISPR-Cas系统与RNA适体结合的DNA成像体系过于复杂，作者希望将RNA适体结合到crRNA上进行简化（图9a）。作者先将RNA适体直接插入到crRNA的3’端，并在RNA适体前加入一段0-16nt的连接子。经过测试后发现，不同靶标、不同适体所需的连接子长度存在差异，需要根据具体系统设计。因此作者考虑将RNA适体直接插入到DR中，并对不同位点进行测试，发现V2系统的效果最佳。同时作者在补全插入位置序列完整性后引入单碱基突变以增强切割效率，发现可以提升crRNA的成熟比例。作者挑选V2、V5和V6进行测试，发现V6的成像效果最好（图9b-f）。最后，作者选取Boxb、Pepper、PP7和MS2，分别插入到gSatⅠ、gSatⅢ、gSatα和gSatⅡ的crRNA中，并在其对应的RBP上修饰不同的荧光集团。共聚焦结果显示，CRISPRdelight体系成功实现了以上四种DNA的成像，证实该体系可以用于DNA的多路成像（图9g，h）。
1、作者筛选出了HyperCas12a系统，证实其可用于基因组DNA成像，且效果优于现有的CRISPR-Cas9系统。
2、CRISPRdelight可对非重复位点进行有效成像，且特异性与成像效率与DNA FISH相近，并具有通用性和鲁棒性。
3、CRISPRdelight可动态检测DNA的活动并评估其基因活性。
4、CRISPRdelight可结合RNA适体实现多路成像。
撰稿：张宗仁
校对：彭瑞资
编辑：侯佳宁
