大家好，今天给大家分享的是2024年4月发表在Nature materials上的“DNA折纸装置在空间上控制CD95信号传导以诱导类风湿性关节炎的免疫耐受”。
类风湿性关节炎（RA）：是一种影响多关节的系统性自身免疫性疾病。炎症过程的特征是各种炎症/免疫细胞（T细胞、B细胞和巨噬细胞）浸润到滑膜组织中，导致关节和骨骼的进行性破坏。RA的治疗目标是消除炎症滑膜组织中激活的免疫细胞，以减轻自身免疫反应。
CD95/CD95配体（CD95L）信号通路：CD95及其配体CD95L在激活的淋巴细胞的消除和自身抗原诱导的免疫耐受中发挥关键作用。CD95信号的激活可以通过诱导激活免疫细胞的凋亡来治疗RA。CD95受体在未激活状态下以六边形图案排列，与CD95配体结合后，受体进一步聚集形成六聚体信号复合体，并启动下游信号传导。
DNA折纸技术：DNA折纸是一种利用DNA的可编程性和可预测性来创建复杂纳米结构的技术。通过设计特定的DNA链，可以折叠成各种形状和图案，以精确的空间控制排列分子。
RA治疗的现状和挑战：尽管目前有多种治疗RA的药物和疗法，但大多数患者仍未能实现长期疾病缓解，且现有治疗常常伴随着严重的副作用。因此，开发新的治疗方法，特别是那些能够有效治疗RA且副作用较小的治疗方法，是当前的一个重要目标。
目前的研究瓶颈在于如何精确控制CD95配体的空间排列，以实现对免疫细胞信号传导的精确调控。传统的方法往往无法实现这种精确性，因为它们无法控制配体的空间排列和间距。为了解决当前治疗方法的局限性，福建师范大学杨震教授、南京邮电大学晁洁教授与新加坡国立大学陈小元教授报道了一种DNA折纸纳米装置，用于空间控制CD95信号传导。这种纳米装置可以通过精确的空间排列CD95L分子，诱导CD95受体的高级别聚集，从而抑制CD95信号通路的激活。此外，纳米装置还可以通过调节pH值来实现构象转变，进一步增强其治疗效果。
已经证明，跨膜CD95受体以六边形图案预先排列在“非信号”静止状态，并且在与CD95L结合后，它们进一步排列成分子间距离约为10 nm的六聚体超分子簇，以组装用于信号转导的细胞内复合物（图1a）。该研究团队设计的DNA折纸以二维六边形图案来显示CD95L阵列，分子间距约为10 nm，与跨膜 CD95受体簇的几何排列非常吻合（图1b-c），基于I-motif DNA序列的紧固件进一步耦合到DNA折纸，以响应pH触发实现可逆的构象关闭和打开转变。设计的DNA折纸在中性条件下保持闭合构型，在弱酸性环境下转变为开放构型，以暴露CD95L阵列的六边形图案。这一特征极大地增强了炎症滑膜组织(pH ~6.5)中活化免疫细胞中CD95诱导死亡信号的选择性激活，同时保留了肝脏中表达低水平CD95受体的健康肝细胞 (pH ~7.4)，从而最大限度地减少了肝毒性（图1d）。
添加了6对I-motif DNA序列的紧固件之后，在中性条件下(pH ~7.4)， DNA折纸纳米器件组装成封闭结构，从而屏蔽了CD95L阵列在内表面。相比之下，当pH值降至6.5时，纳米器件呈现出完全开放的结构，以暴露内部的CD95L阵列（图2a-c）。为了研究CD95L纳米尺度间距对CD95受体激活的影响，该团队开发了三组DNA折纸纳米片，分别在5、10和30 nm的分子间距离上显示CD95L，分别称为NS-5、NS-10和NS-30（图2d、e）。大约70%的NS-10含有6个锚定的CD95L分子，表明CD95L在每个结合位点都被有效捕获。为进一步研究CD95L阵列的纳米级排列是否会影响CD95信号传导的启动，他们检测了NS-5、NS-10和NS-30对A20 (B淋巴细胞系)和Jurkat (T淋巴细胞系)细胞的凋亡作用。这些结果表明，可溶性CD95L（sCD95L）在某种程度上是无活性的，并且表现出最小的细胞凋亡诱导能力。NS-10的CD95L阵列模式与该配体-受体复合物模型精确匹配，表现出最大的效力。接下来，研究了ND-10的细胞凋亡诱导作用。在中性条件下ND-10处理后，检测到可忽略的细胞凋亡（图2g）。然而，在酸性条件下，ND-10显著增强A20和Jurkat细胞的凋亡。
根据目前的CD95信号传导模型，活性CD95L的结合诱导CD95受体在细胞表面聚集，从而启动信号转导（图3a）。为了揭示NS-10优越性能背后的机制，研究人员接下来研究了NS-10刺激后CD95受体的分布。图3b证实A20细胞在NS-10处理下表现出CD95的高阶聚集， NS-10刺激2 h后，CD95受体分布变化为高度聚集的斑点型；相反，用NS-empty处理或sCD95L处理不会引起CD95分布的可检测变化。同时还监测了ND-10对CD95受体分布的影响。在中性条件下，ND-10处理后CD95受体分布没有显示出聚集的迹象，进一步证实了纳米装置的屏蔽作用。后续进一步研究了受体响应NS-10处理的内吞作用。NS-10刺激后2小时，A20细胞中的大多数CD95受体被内化并转移到早期内体（图3c）。为了确定受体-配体复合物的内吞作用是否可以启动信号转导，研究人员检测了下游的caspase 8的激活，结果表明，NS-empty的和sCD95L都不会导致A20或Jurkat细胞中裂解的caspase 8表达上调（图3d）。相反，在NS-10处理后裂解的caspase 8表达显著增强，表明受体-配体复合物的内化触发下游信号传导。此外，这些凋亡细胞很容易被骨髓源性巨噬细胞吞噬（图3e），并促进TGF-β的释放（图3f），TGF-β一种典型的抗炎细胞因子。
为了评估DNA折纸纳米装置是否能有效地在炎症滑膜组织中积累，本文建立了胶原诱导的关节炎(CIA)小鼠模型。为了观察DNA折纸纳米装置在体内的分布，本文对staple链采用Cy5.5进行修饰。近红外荧光成像显示，注射ND-Cy5.5后，健康小鼠关节和脚掌荧光信号微弱（图4a）。与此形成鲜明对比的是，ND-Cy5.5在CIA小鼠的炎症关节和爪子中逐渐积累，并在注射后12 h达到峰值。通过以上推断，发炎关节中的水肿和新生血管都增强了ND-Cy5.5的渗透和滞留。体外成像进一步显示，发炎关节和爪子中的荧光信号比健康关节和爪子中的荧光信号要强得多（图4b、c）。接下来，研究人员研究了DNA折纸纳米装置是否能够将CD95L阵列屏蔽在肝细胞之外，以防止肝损伤。在ND-empty处理或ND-10处理后，未检测到血清丙氨酸转氨酶（ALT）或天冬氨酸转氨酶（AST）升高（图4d）。肝脏组织学分析显示，ND-10处理后没有肝脏出血或肝细胞凋亡的迹象（图4e）。以上数据表明，DNA折纸纳米装置确实可以保护内部CD95L阵列不到达肝细胞，从而防止肝损伤。
由于DNA折纸是由DNA支架和大量的DNA链组成的，接下来评估了其免疫调节潜力。静脉注射后，在48 h内，ND-empty处理导致血清TNF-α、IL-6和IL-1β浓度增加可忽略不计（图4f）。此结果证实了DNA折纸具有免疫惰性，即在没有递送载体的情况下使用的核酸纳米颗粒是免疫静止的。
接下来，本文根据图5a所示的治疗方案评估了设计的DNA折纸在CIA小鼠中的治疗效果。用甲氨蝶呤（MTX）或抗TNF-α单克隆抗体（mAb）处理的小鼠作为阳性对照。ND-empty处理并不能减轻关节炎（图5b）。与此形成鲜明对比的是，MTX、抗TNF-α mAb和ND-10都显著延缓了疾病的进展，并伴随着关节炎的增加速度也比较缓慢。用ND-10处理的小鼠的爪肿胀程度与接受MTX或抗TNF-α mAb处理的小鼠相当，显著低于PBS和ND-empty组的爪肿胀程度（图5c）。Micro CT成像显示，PBS和ND-empty组小鼠的关节发生了严重的骨侵蚀（图5d）。采用MTX、抗TNF-α mAb或ND-10治疗可显著抑制骨侵蚀，关节形态与健康小鼠相似。关节的苏木精和伊红（H&E）染色表明在采用PBS或ND-empty处理的小鼠中出现严重的骨破坏，而采用MTX、抗TNF-α mAb或ND-10处理的小鼠表现出最小的病理特征（图5e）。此外，在PBS和ND-empty组中，TNF-α、IL-1β和IL-6的血清浓度显著升高（图5f）。MTX、抗TNF-α mAb和ND-10处理组都显著降低了这些促炎细胞因子的浓度，使其接近正常水平，表明关节炎在全身水平上得到了缓解。
随后，他们研究了发炎滑膜组织中的免疫细胞特征。免疫组织化学分析显示，在PBS组小鼠的滑膜组织中富集了大量表达CD95受体的炎症细胞（图5g）。与PBS组形成鲜明对比的是，ND-10治疗小鼠滑膜组织中很少观察到CD95阳性细胞、CD19阳性B细胞或CD3阳性T细胞。此外，在ND-10处理的小鼠滑膜组织中，促炎细胞因子的表达显著降低（图5h）。以上结果表明，局部消融激活的免疫细胞可以降低促炎细胞因子水平，从而改善滑膜组织的炎症。
本文开发了一种设计型DNA折纸，将CD95L阵列排列成纳米级精度的二维六边形图案，以调节发炎滑膜组织中活化免疫细胞的CD95信号，从而逆转RA。CD95信号的激活在空间上受CD95L纳米级分布的控制。DNA折纸显示了分子间距为10 nm的六边形CD95L阵列，由于具有精确的模式识别能力，因此是激活CD95信号的最佳选择。基于I-motif DNA序列的紧固件与DNA折纸进一步耦合，使DNA折纸纳米器件具有可逆关闭和打开的特性，从而在空间上控制CD95L阵列在体内的活性。全身给药后，ND-10可在发炎关节中有效聚集，并特异性暴露CD95L阵列，激活发炎滑膜组织中活化免疫细胞的CD95信号，同时保护健康肝细胞，从而缓解慢性炎症，促进CIA小鼠模型的局部免疫耐受。
撰稿：余黄磊
校对：张朝
编辑：侯佳宁
