大家好，今天给大家分享近日发表在Sci Adv上的一篇文献，题名“Autonomous assembly and disassembly of gliding molecular robots regulated by a DNA-based molecular controller”。
本文的通讯作者是日本京都大学理科研究生院教授Akira Kakugo和日本东北大学工程研究生院教授Shinichiro M.Nomura，他们的研究方向主要包括分子机器、分子计算、DNA纳米结构、应用生物物理学等。
由于DNA具有可编程性和高反应特异性，非常适用于分子机器的构建，现在已经开发了一些具有动态机器人功能的基于DNA的分子系统，如毫米级的机械工具、分子传感器、货物运载器。然而，目前基于DNA的分子系统的主要缺点是速度慢、驱动能力小、依赖于手动添加外部刺激。
针对以上问题，作者将多种核酸酶整合至DNA链置换反应加速其驱动、利用微管蛋白聚合物放大运动，并利用DNA的级联反应设计了一个分子控制器，用以驱动DNA功能化微管的自主组装并延迟一段时间自主解离，为基于自主分子系统的纳米技术提供了思路。
该系统包括两个关键组件:驱动蛋白驱动的微管和分子控制器。两种DNA结合的微管通过ATP水解在驱动蛋白涂覆的玻璃上滑动，而DNA和酶则作为调节微管运动的控制器(图1A)，它依次产生两条DNA链，作为组装和拆卸信号(图1B)。
由于与两种微管连接的单链DNA都具有与LinkerDNA链互补的碱基序列，因此它们可以在Linker存在的情况下相互结合。当双链被新产生的入侵DNA取代时，就会发生解离(图1C)。
分子控制器通过一系列链取代和酶促反应产生两种不同的效应DNA链。如图2所示，该系统主要由三种DNA复合物和三种酶组成。
通过级联反应可自主执行三个基本步骤。第一步是信号链的合成，这导致了驱动微管连接的Linker的产生(图2A)。在第一步中，聚合酶将模板链延长，并由切口酶切割DNA，释放一段短单链DNA作为信号链。在完整模板存在的情况下，延伸和切割循环重复，导致信号放大。然后，信号链与携带Linker的Converter杂交，聚合酶对信号链的延伸使Converter上的Linker被取代下来。释放的Linker将结合到微管上的单链DNA连接起来，导致微管组装。
第二步是信号链与Transducer杂交(图2B)。因为其互补区域更短，信号链与Transducer的连接相较于Converter更晚。聚合酶同样进行延伸反应，释放Updater链，留下另一个副产物双链。释放的Updater随后与模板杂交，并进行toehold介导的取代反应，第一步的放大信号随即停止。
第三步是从微管中移除Linker(图2C)。模板和Updater的复合体具有限制性内切酶的识别位点并被切割。聚合酶和切口酶进行新的延伸和切割循环，产生一种短单链称为解离链，其和Linker剩余的单链区域杂交，并经聚合酶反应将Linker取代下来。此处，第二步和第三步的反应级联提供了一个合理的延迟，使微管在组装一段时间后自发解离。
作者设计了微管上连接的不同受体DNA链，使用了15和16个核苷酸长的互补区域来保证与Linker形成稳定的二聚体，并添加了尾端poly-T保证链取代反应顺利进行(图3)。
作者先探索了合适的实验条件。在37℃的工作温度下，作者确定了高盐环境可更好地维持酶活性，并利用PIPES缓冲液代替了TRIS缓冲液，保证了DNA和微管-驱动蛋白系统之间的兼容性(图4)。通过降低DNA浓度和增加酶浓度，终止整个反应所需的时间缩短(图5)。
为了表征Linker的自主生成和失活，作者在没有微管的条件下进行了天然聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据孵育不同时间的样品的条带深度估计Linker浓度变化及反应情况(图6)。观察到Linker的浓度随时间增加，约15 min时达到最大，而后逐渐降低，约60分钟后可忽略不计。而与解离链结合的Linker浓度在15分钟后增加，在60分钟基本不变，表明Linker在没有任何外部控制的情况下自主产生和失活。
作者进一步评估了Linker和受体DNA之间的连接(图7)，观察到大约在20min形成最多复合体，相较Linker的产生略有延迟。
作者还利用信号链和解离链分别互补的不同信标DNA证实了信号链的即时产生和解离链的延迟产生(图8)。
作者用叠氮化物修饰的微管蛋白单体聚合为微管束，并将其与两种受体DNA通过无铜点击反应偶联。两种DNA链用不同的荧光染料标记（FAM：绿色，TAMRA：洋红色），确保荧光显微镜下可观测到。
为了评估分子控制器是否可以驱动微管的自主装配与拆卸，作者首先将两种DNA偶联的微管以相同的比例放置在驱动蛋白包被的玻璃上。DNA连接的微管由驱动蛋白推动，ATP水解提供动力。与通链霉亲和素-生物素吸附相比，直接附着的驱动蛋白对盐的稳定性更高(图10)。然而，长时间观察发现由于玻璃表面的吸附作用，固定的微管数量增加(图10)，且没有DNA和酶的情况下微管密度随时间减少(图11)，说明反应时间不能过长。
图12展示了微管组装和解离的全过程。最初，受体DNA1(绿色)和受体DNA2(洋红色)结合的微管随机移动。10分钟后开始聚集连接(合并为图像中的白色)。30分钟后，微管聚集体开始分离, 50分钟后，大多数微管分离并回到离散状态。
在整个观察过程中，离散微管的速度几乎恒定，这表明分子控制器不会干扰微管的滑动活动(图13)。作者还能够通过调节限制性内切酶的浓度来改变解离的时间，这证明了系统的可编程性(图14)。
为了量化微管的组装/解离性能，作者计算了每个时间点图像中绿色和洋红色的像素点共定位比例(图15)。这一比例从13%左右开始，到观察20min升到最高，达到50%。20 min后，比例开始下降，50 min时达到21%(图15右黑色曲线)，定量证实了在分子控制器存在下微管的短时组装。这种时间变化与凝胶电泳测定的Linker-受体DNA1-受体DNA2 的浓度变化(图15右红色曲线)很好地吻合。它们之间的对应关系强烈表明，观察到的组装和解离是由于酶促反应产生Linker和解离DNA。
为了描述微管群体的动态特征，作者使用差分动态显微镜(DDM)测量微管在时间上的动态结构及运动变化，反映分子系统的动力学改变(图16)。
作者使用了两种不同的观测波长（分别对应单个微管和微管聚集体）。他们发现，微管单体的弛豫时间几乎随时间单调增加，表明微管的移动性逐渐降低。而微管聚集体的弛豫时间大约观测后20min开始增加，在30min开始下降，最终回到初始状态，这表明了动态结构的形成和消失，与系统设计相吻合。
本研究表明，一个DNA化学反应系统可以自发先后生成两种类型的DNA链，并驱动DNA功能化的微管在没有外部控制的情况下自发实现组装和解离。并且通过DDM分析可量化该种转化，证实了两种微管的共定位并聚合形成大的可活动结构，可持续存在大约20分钟。
该分子系统提供了一个自主控制材料的新概念，通过拓宽反应条件、增加DNA系统的指令种类、人为控制延时时间、响应周围环境的变化等，可能可以应用于更多的场景，创造更智能的分子机器。
撰稿：沈心怡
校对：张朝
编辑：侯佳宁
