2024年5月西湖大学张鑫教授团队在J. Am. Chem. Soc.上发表了题为lonic effect on the microenvironment of biomolecular condensates的研究成果，该论文主要研究了离子对蛋白质凝聚体微环境的影响。
张鑫团队聚焦于生物有机化学和蛋白质生物化学的交叉领域，以“生物大分子相分离和聚集的化学生物学”为研究中心，瞄准此研究领域亟需解决的重要技术和科学问题，为基础生物学和生物医药产业提供科学支持。
以核仁、应激颗粒为代表的无膜细胞器凝聚生物分子参与细胞活动，这些微隔室通过液-液相分离组装，也被称为生物分子凝聚体。在生物分子凝聚体中，生物分子的富集和脱水导致凝聚体内形成不同于周围溶液的微环境，比如极性、粘度、pH和表面张力。凝聚体微环境影响着生命活动，如核仁等多相凝聚体的微极性会影响其分层行为。然而，生物分子凝聚体是由弱多价相互作用维持的，轻微的扰动就可能导致其微环境性质发生改变，进一步去影响凝聚体的功能。目前凝聚体微环境如何响应环境的变化尚不清楚。在过去，离子对蛋白质相行为的影响得到了较为广泛的研究。根据沉淀蛋白质的能力，Hofmeister序列将离子划分为盐溶离子和盐析离子，盐溶离子能够促进蛋白质的溶解，盐析离子倾向于将蛋白质从溶液中析出。但是在蛋白质发生相分离时，离子对凝聚体微环境的影响尚未得到阐明。
作者选取了Hofmeister序列末端的盐溶(Gdn+,SCN-)和盐析离子(NH4+,SO42-)与序列中间的Cl-或Na+配对，来探究离子对于蛋白质凝聚体微环境的影响(图1A)。本文主要研究了两种内在无序蛋白模型:elastin-likepolypeptide(ELP)和resilin-likepolypeptide(RLP)，ELP具有低临界温度(LCST)，由疏水相互作用驱动相分离（图1B），RLP具有高临界温度(UCST),由静电相互作用、阳离子-π相互作用、π-π堆积等多种相互作用驱动相分离(图5A,B)。为了揭示凝聚体内部的物理性质，作者采用了BODIPY和SBD两种环境敏感探针，并借助探针荧光寿命成像(FLIM)对凝聚体的微环境进行定量表征。BODIPY具有黏度敏感性，其荧光寿命随着微黏度的增加而增加；SBD具有极性敏感性，其荧光寿命随着微极性的增加而降低(图1c)。
作者将微环境探针共价连接到ELP末端，并在不同盐溶液中形成了凝聚体(图1D)，此后测定凝聚体的荧光寿命(图1E)，结果显示，盐溶离子（Gdn+，SCN-）提高了ELP凝聚体的微极性，同时降低了微粘度;而盐析离子（NH4+，SO42-）带来截然相反的影响(图1F,G)。这种微极性和微粘度的协同变化说明离子可能通过调控蛋白质的水合情况而改变微极性，水合情况的转变影响了蛋白质链间的相互作用，进一步导致微粘度的变化。
为了揭示离子对ELP凝聚体微环境影响的更多细节，作者选取了5种具有不同初始微环境性质的ELP凝聚体进行了进一步的研究。结果显示，盐溶阴离子SCN-提高了所有凝聚体的微极性（图2B），降低了其微粘度(图2D)，但随着SCN-浓度的不断增加，两种效应会进入平台期。这表明弱的水合离子SCN-引入水的能力有限，过多的SCN- 增加了界面张力，反而使极性轻微降低。与SCN-不同的是，随着盐析阴离子SO42-浓度的提高，凝聚体的极性不断下降(图2C)、粘度不断上升(图2E)。这是因为强的水合离子SO42-会在肽-水界面耗尽，并通过极化作用竞争多肽水化层的水，使多肽间疏水相互作用的加强，表现出强烈的盐析作用。
盐溶阳离子Gdn+与蛋白质主链结合显著增强了蛋白质的水化，使凝聚体的微极性升高、微粘度降低，且没有平台期(图3B,D)。盐析阳离子NH4+与盐析阴离子SO42-效果相近，都显著降低了凝聚体的微极性、并提高其微粘度(图3C,E)。
为了从多个尺度了解离子对蛋白质凝聚体的影响，作者考察了蛋白质凝聚体的介观性质受离子条件的影响。首先,借助光漂白后荧光恢复实验(图4A)，发现盐溶离子增加了ELP凝聚体的流动性，荧光恢复率得到了提高；相反，盐析离子降低了荧光恢复速率，这表明凝聚体中多肽链的运动受到了抑制(图4B)。作者跟踪了浸没在凝聚体中荧光纳米珠的运动(图4C)，发现盐溶离子扩大了纳米珠的运动范围，而盐析离子几乎固定了凝聚体中的纳米珠(图4D)。这些结果表明，凝聚体的介观性质(粘弹性)可以被离子调节。
除了疏水作用力，蛋白质的相分离还可以由其它多种作用力驱动。于是作者又采用了一种由多种相互作用驱动相分离的RLP模型作为研究对象(图5A,B)。由于盐溶离子(Gdn+和SCN-)破坏了RLP凝聚体的形成，因此后续只考察盐析离子(NH4+和SO42-)对其微环境的影响。作者发现，随着SO42-浓度的提高，RLP凝聚体的微极性持续下降、微粘度持续上升(图5C)；而在NH4+条件下，RLP凝聚体的微环境变化出现两个阶段：随着NH4+的增加微极性先上升再下降，微粘度先下降再上升(图5D)。作者猜测在NH4+条件下，第一阶段的反常盐溶现象是由蛋白质间的静电相互作用被NH4+屏蔽导致的，随着NH4+浓度的不断提高，NH4+的盐析作用逐渐起主导作用，即破坏蛋白质骨架的水化层促进盐析。
在详细研究离子对凝聚体微环境的效应后，作者进一步探讨能否利用这种效应调控凝聚体的功能。他们以前的一项研究表明，微极性能够控制多相凝聚体的混溶和分层，这启发他们探索离子调控多相凝聚体混溶性的潜力(图6A)。对于部分混溶(图6B)和完全不混溶(图6C)的多层凝聚体模型，随着盐溶离子的不断加入，凝聚体中多相间的极性差异不断被不断减小，因此混溶程度得到了加强。盐溶阴离子、阳离子的组合（GdnSCN）具有更强的调节能力，较低浓度下即可促进凝聚体的完全混溶(图6D)。
有研究表明RNA的分配会受到凝聚体微环境的影响。受此启发，作者探究了离子是否可以调节RNA在蛋白质凝聚体中的分配，他们发现盐溶阴离子SCN-仅使RNA在凝聚体中的分配略有增加，而盐溶阳离子Gdn+显著提高了RNA在凝聚体中的富集，这可能是因为凝聚体的微环境变化和阳离子-RNA相互作用联合提高了RNA在凝聚体中的募集(图7D)。
作者猜测蛋白质与离子之间的相互作用可能会在相与相间诱导离子梯度，这会引起电势的变化。接下来作者将电势探针Di-4-ANEPPS扩散到不同离子条件下形成的凝聚体中，借助比率成像测量电位，发现盐溶离子使凝聚体中荧光比率减小，盐析离子导致比率增大，可能暗示了离子可以调控蛋白质凝聚体的电势(图7E)。
该研究揭示了离子对蛋白质分子凝聚体微环境的影响：盐溶离子增加了凝聚体的微极性，降低了微粘度；而盐析离子与之相反，降低了凝聚体的微极性，提高了微黏度。为解释生物分子凝聚体如何响应生理条件而发生微环境的转变提供了帮助。
撰稿：褚利康
校对：彭瑞资
编辑：侯佳宁
