时空组学文章精读|一篇Cancer Cell是如何练成的？

企业 2024-11-22 17:25 天津

【发表期刊】Cancer Cell

【影响因子】48.8

【发表时间】2024.8

【研究方向】结直肠癌肝转移三级淋巴结构形成与抗肿瘤机制

【样本类型】178例患者病理分析、14例患者单细胞转录组和免疫组库（19个样本）、 10例Stereo-seq空间转录组

【研究方法】10x单细胞测序、Stereo-seq空间转录组、bulk RNA-Seq、免疫组化、流式细胞术、单抗体外表达、抗体依赖的细胞吞噬实验、移植瘤小鼠功能实验、ELISA

【科学问题】结直肠癌肝转移（CRLM）发生在几乎50%的结直肠癌患者中，并导致超过70%的结直肠癌相关死亡。三级淋巴组织（TLSs）与肿瘤中的增强免疫反应有关。然而，它们在结直肠癌肝转移（CRLM）中的形成和功能仍不清楚。

结果

评估肿瘤浸润淋巴细胞（TLSs）在结直肠癌肝转移（CRLM）患者中的预后意义

根据TLSs的分布和成熟度，我们将CRLM的肿瘤微环境（TME）分为四类：

结构化的TME（存在iTLSs和pTLSs，n = 20）

排除性TME（pTLSs成熟但不能穿透肿瘤床的TME，n = 35）

未成熟TME（pTLSs未成熟且无iTLSs，n = 90）

荒漠化的TME（无iTLSs和pTLSs，n = 33）

1.具有结构化或排除性TME的患者比未成熟和荒漠化TME的患者有显著更长的总生存期（OS）和无复发生存期（RFS）。

2.具有结构化和排除性TME的患者归类为TLS阳性（TLS+），具有未成熟和荒漠化TME的患者归类为TLS阴性（TLS-）。

图1

探索TLS在CRLM中的形成机制和功能

1.本研究重新分析了之前发表的CRLM的bulk RNA测序数据，TLS基因评分在TLS+ CRLM中显著较高，验证了之前描述的分组标准的可靠性

2.差异表达基因（DEGs）分析显示，TLS+肿瘤中的免疫球蛋白基因水平较TLS-肿瘤高，且TLS+肿瘤的DEGs富集在免疫激活通路中，包括白细胞激活的正调控和抗原受体介导的信号通路

3.MCP-counter分析，发现相比于TLS-肿瘤，TLS+肿瘤中的B细胞和CD8+ T细胞显著富集

4.单细胞分析鉴定了六种主要的细胞类型，包括成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、T和NK细胞、B&浆细胞、髓系细胞，这些细胞类型根据基因表达谱进一步细分为31个亚群

5.浆细胞是肿瘤免疫细胞群体中的主要细胞类型，而B细胞在相邻肝组织中更为丰富

6.TLS+肿瘤表现出更高的IgG+ 浆细胞比例，而TLS阴性肿瘤则以IgA+ 浆细胞为主

图2

精确研究浆细胞的分类分布

1.整合了配对的BCR-seq和scRNA-seq数据，IgG同型（IGHG1-4）在TLS+肿瘤中富集，而IgA同型（IGHA1-2）在TLS-肿瘤中普遍存在，mIHC染色显示在TLS附近有大量IgG+ CD138+浆细胞。

2.对6个TLS+和4个TLS-的CRLM样本进行了空间转录组测序（Stereo-seq），总共识别出154个TLS样结构，结果显示在TLS附近聚集了更多的IgG+ 浆细胞，而IgA+ 浆细胞则散布在非TLS区域。这些数据表明TLS与IgG+浆细胞（而非IgA+浆细胞）之间的紧密空间关联。

图3

为什么在TLS附近PCs的同种型不同

1.免疫球蛋白基因分析显示，TLS+样本中B细胞系的IGHV4-39丰度较高，而J区基因片段和轻链基因的频率显示出较大的相似性，表明在B细胞发育早期阶段，VDJ重排过程相似

2.构建了B细胞系的发育轨迹，发现TLS+ CRLM中主要由IgG+ PCs组成的一个分支。

3.伪时间分析表明，TLS+肿瘤中的B细胞倾向于转换为IgG，而TLS-肿瘤中的B细胞倾向于转换为IgA

4.TLS+ CRLM中B细胞系的突变频率和抗体亲和力评分较高。TLS+肿瘤中的PCs显示出较低的多样性和更高的克隆频率

图4

TLS周围IgG+浆细胞的富集的功能是什么？

1.mIHC发现TLS+样本中更多的CK20+肿瘤细胞被IgG抗体包围，CD68+巨噬细胞在肿瘤中丰富，并与IgG标记的CK20+肿瘤细胞共定位，而NCR1+ NK细胞在肿瘤基质中稀少且分散。

2.在IgG标记的肿瘤细胞中观察到比未标记的肿瘤细胞更高的活化caspase-3表达，表明IgG抗体结合肿瘤细胞可能会触发其凋亡。

3.stereo-seq数据表明，与IgA+浆细胞周围的肿瘤相比，IgG+浆细胞附近的肿瘤在凋亡通路上显著富集。这些发现表明TLS通过产生和传播IgG抗体来增强巨噬细胞介导的抗肿瘤活性。

4.单细胞髓系细胞评分显示TLS+ CRLM中的巨噬细胞表现出比TLS- CRLM中的巨噬细胞更高的吞噬作用和抗原呈递评分。

图5

进一步证明在CRLM中原位生成的抗体对肿瘤的反应性

1.三名CRLM患者的肿瘤和肿瘤周围肝组织中与CK20（CRC细胞标志物）共同染色嵌合mAbs，大多数mAbs在肿瘤组织中比在肿瘤周围肝组织中表现出更强的信号，表明这些抗体可能与肿瘤相关抗原结合

2.mAb6在所有三名患者中显示出显著更高的肿瘤结合活性，而不是肝脏，这表明其可能识别CRLM中的保守肿瘤抗原。尽管几种mAbs与CK20共同染色，mAb6在所有20种mAbs中显示出最高的对CK20+区域的结合

图6

3.研究比较了所有20种单克隆抗体对人类CRC细胞系（HCT116、HT29）与非癌症肝细胞系（MIHA）的结合能力。通过流式细胞术，发现mAb3/mAb6/mAb7/mAb9在两种癌细胞系中的结合信号显著高于在肝细胞中的结合信号，免疫荧光（IF）染色进一步证实了这一结论

4.为了检验这些肿瘤结合单克隆抗体是否具有抗肿瘤活性，在体外使用培养的人类CRC细胞（HCT116、HT29）进行了ADCP实验（抗体依赖的细胞吞噬实验）并在携带人类CRC（HCT116）的重度人源化小鼠体内进行了抗体注射实验，mAb6/mAb7/mAb9增强了巨噬细胞对HCT116和HT29细胞的吞噬作用

图7

5. 进一步探索这些肿瘤结合单克隆抗体的治疗潜力，选择了mAb6进行体内功能检测。将人类CRC细胞（HCT116）皮下注射到携带人类免疫细胞的小鼠中，即携带人类癌细胞的重度人源化小鼠。然后将mAb6、PBS或同型对照分别注射到肿瘤部位，mAb6的2周治疗在体内显著抑制了肿瘤生长，相较于PBS和同型对照，且对系统性免疫无重大变化。总体而言，这些发现提供了直接证据，支持TLS相关PC衍生单克隆抗体的抗肿瘤活性。

图8

CRLM 的TLS形成过程中B细胞是如何被招募的

1.B细胞上已知趋化因子受体的表达情况分析显示CCR7+ B细胞在TLS+肿瘤和邻近的肝组织中更加富集，而TLS-肿瘤中的B细胞表达低水平的CCR7。

2.cellchat分析了naive B细胞与其他细胞群体之间的相互作用,在TLS+肿瘤和肝组织中观察到F2_CAF的CCL19-CCR7趋化因子轴，而在TLS-肿瘤中则没有观察到。

3.由于CXCL13被认为是一种著名的淋巴结构组织趋化因子，mIHC比较了CRLM中CCL19和CXCL13蛋白的分布，我们观察到TLS+区域中CCL19和CXCL13的密度高于TLS-区域。

4.CCL19在所有阶段的TLS中均有分布，而CXCL13的分布与TLS的成熟阶段相关

5.mRNA的空间分布模式通过Stereo-seq分析得到确认，这些数据表明CCL19可能在TLS形成的早期阶段起主要作用，而CXCL13可能对TLS的成熟至关重要。

图9

6.CellChat分析表明F2_CAFs的重要作用，成纤维细胞差异分析表明，在F2_CAFs中，C5_CAF_CCL19在TLS+肿瘤和肝组织中富集，其特点是高表达CCL19、CCL21和IL-33，中等表达CXCL12，而不表达CXCL13

7.IgA+/IgG+ 浆细胞的比例与C5_CAF_CCL19的频率显著负相关，这与bulk RNA-seq分析一致

8.mIHC以确认CCL19+ CAF与TLS的空间关联。TLS+ CRLM中，结构化的CCR7+ CD20+ B细胞被大量CCL19+ COL1A1+成纤维细胞包围，而TLS-样本缺乏CCL19+ 成纤维细胞和CCR7+ 免疫细胞。

综上所述，CCL19+ CAFs可能在CRLM中促进B细胞浸润和TLS的形成。

图10

由CAF产生的CCL19促进CRLM中TLS形成及临床预后影响评估

1.在CRLM小鼠模型(即通过肝内或脾内注射小鼠CRC细胞)中肿瘤内注射了PBS、CCL19或CCL19加抗CCR7抗体，CCL19治疗在这两种模型中均显著减少了肿瘤的体积和重量，且CCL19的抗肿瘤活性依赖于CCR7

2.为了比较CCL19和CXCL13在TLS形成中的功能，在CRLM小鼠模型中进行局部治疗，分别用CCL19、CXCL13或两者结合。CCL19和CXCL13都促进了B细胞的浸润和聚集，并抑制了肿瘤的生长。CCL19和CXCL13联合治疗导致更显著的TLS形成和肿瘤的抑制

图11

3.ScRNA-seq数据显示，CCL19主要由F2_CAFs表达，mIHC染色证实了这一点。

4.Stereo-seq数据显示，CCL19表达与F2_CAF评分呈正相关，这一点由另一份已发表的空间转录组数据集证实。TLS中的成纤维细胞比TLS外的成纤维细胞表达更高的CCL19。这些结果表明CCL19主要由F2_CAFs表达，提示需要进一步研究其临床相关性。

5.在CRLM的一个bulk RNA-seq数据集中，我们发现CCL19表达较高与更好的总生存期（OS）相关。此外，在TCGA COAD的CRC数据集中，CCL19与TLS基因评分呈正相关，并且与较早的肿瘤阶段和更好的预后相关。这些结果表明CCL19是TLS和CRLM患者生存的潜在有价值预测因子。

图12

总结

本研究使用单细胞RNA测序技术和空间转录组技术（Stereo-seq），发现TLS+肿瘤富含IgG+浆细胞（PC），而TLS-肿瘤则以IgA+浆细胞（PC）为特征。通过体外生成TLS相关的PC来源的单克隆抗体，表明TLS 相关PC分泌靶向肿瘤的抗体。在结直肠癌人源化小鼠模型中展示了TLS-PC-mAb6抗体的抗肿瘤活性。确定了一种分泌CCL19的成纤维细胞亚群，这种亚群促进了淋巴细胞向三级淋巴组织的迁移。CCL19治疗促进了三级淋巴组织的新生，并在小鼠中抑制肿瘤生长。本研究的数据揭示了CCL19+成纤维细胞在三级淋巴组织形成中的核心作用，进而产生治疗性抗体以抑制CRLM。

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