单细胞CRISPR筛选的前世今生
目前单细胞CRISPR筛选方法包括Perturb-seq、CRISP-seq、CROP-seq、Mosaic-seq等，但很多方法都还停留在实验室开发阶段，且有成本、限制条件较多、应用面窄等诸多不利因素，而direct capture Perturb-seq[1]技术克服了这些缺陷，该技术利用10x Genomics平台的单细胞捕获技术，对样本中每个细胞进行barcode标记区分，实现一个样本同时分析数千个细胞的表达谱，以及其中的近百种CRISPR扰动，并将每一个细胞受到的CRISPR扰动类型准确记录。因此能够高通量地呈现细胞类型特异性的基因功能和通路信息，揭示受干扰的基因潜在的功能作用。诺禾致源也是在此技术基础上提供了完整的单细胞CRISPR筛选解决方案！
图1 10x Genomics 单细胞CRISPR筛选捕获建库原理
诺禾致源单细胞CRISPR筛选解决方案
图2 诺禾致源基于10x单细胞捕获的高通量CRISPR筛选解决方案
价格方面也无需多虑，只比常规单细胞转录组测序多加一个单细胞CRISPR富集建库和测序的价格，便能从每个单细胞捕获样品中拿到：约50种sgRNA扰动后的单细胞精度转录本信息，以及每个细胞对应的扰动类型（sgRNA种类）。
图3 诺禾致源高通量单细胞CRISPR筛选服务流程
sgRNA数量的设计原则：推荐针对每个基因设计1-5个sgRNA，总量的10%为非靶向sgRNA，每个sgRNA需捕获100-200个细胞。
例如：预计针对15个靶标基因，每个基因设计3个sgRNA，共5个非靶向sgRNA，总计50个sgRNA（15*3+5），因此需捕获5k-1w个细胞，即对应一次10x捕获。
sgRNA骨架序列的设计原则：为了能够实现单细胞捕获sgRNA，骨架序列中需要加入特定的Capture Sequence（CS序列）。我们推荐进行单细胞5’转录组测序+单细胞CRISPR筛选，因为常规的载体中会包含这段骨架，详细设计方案请您参考10x官方文档[2]（滑到文章结尾，点击阅读原文即可观看）。
图4 单细胞CRISPR筛选数据结果展示
单细胞CRISPR文献案例分享
2020年3月，发表在Nat Biotechnol杂志上的文章Combinatorial single-cell CRISPR screens by direct guide RNA capture and targeted sequencing首次将direct capture Perturb-seq技术应用向公众展示（图6）。
图6 direct capture Perturb-seq的实验设计与验证
图7 体内肿瘤内CTLs（细胞毒性T淋巴细胞）的单细胞CRISPR筛选揭示了共功能模块和基因表达程序的关联。
未来展望
图8 基因功能的高通量筛选验证方法还有2-3个数量级的提升空间（图片来源：综述原文[3]）
诺禾致源单细胞空间测序平台
诺禾致源成立至今已13年，作为创立于中国、服务全球科学家的基因科技产品和服务提供者，诺禾致源的测序实验室已遍布世界各地，海外实验室包括美国、英国、新加坡等等。诺禾致源的单细胞空间测序业务也已辐射全球数十个国家，支持全世界科学家发表高分文章291篇，影响因子共4400+，涉及研究领域和项目经验不仅包括医学研究如肿瘤异质性、干细胞分化、组织器官发育、免疫微环境等等，还有其他哺乳动物、家禽、水生动物、经济作物等众多物种的样本处理经验，成功制备样本30000多例；技术平台囊括10x Chromium、10x Visium、10x Xenium、Stereo-seq、BD Rhapsody、Nanostring DSP、MobiNova、DNBelab C-TaiM 4等多个平台，满足您的多组学研究需求。在未来，诺禾致源将继续秉承“专业、创新、诚信、共赢”的价值观，为您提供更优质的基因科技产品和服务。
参考文章及链接：
