本期荐读丨诺奖（2023）：关于 mRNA 疫苗研发的解读/和渊等

关于 mRNA 疫苗研发的解读

和渊 王一苇 鲁冰 杜军 

（中国人民大学附属中学）

摘要

2023 年诺贝尔生理学或医学奖颁发给 mRNA 疫苗研发团队，以表彰他们在核苷碱基修饰方面的发现。该研究团队将体外合成的 mRNA 中的假尿苷替换为尿苷注射到机体后， 不仅可以减少机体自身的免疫反应，而且还能极大增加 mRNA 的翻译效率，产生更多的蛋白质，这对 mRNA 疫苗的成功研发具有重要意义。

mRNA疫苗  疫苗研发  诺贝尔生理学或医学奖

疫苗是指用各类病原微生物制作的用于预防接种的生物制品，即把减活或者灭活的病原体（或者活性成分）注射到身体内，使自身产生对抗病原体的能力。常用的新型冠状病毒（以下简称新冠病毒）感染疫苗主要包括灭活疫苗、重组蛋白疫苗、腺病毒载体疫苗和 mRNA 疫苗等。 

灭活疫苗、重组蛋白疫苗、腺病毒载体疫苗等是最常见的疫苗，其研发过程比较复杂，需要不断地培育、挑选、处理，在制作完成之后还要经过动物实验和人体临床试验，确认安全且有效之后才能批准入市，这一整个过程可能需要 10 年之久，长周期的疫苗研发流程对于亟需防治的新冠病毒感染过于漫长。 

mRNA 疫苗的设计和生产比传统疫苗的研发周期要缩短很多。一旦已知了目标病原体的遗传信息，就可以相对迅速地开始生产疫苗，而无须像传统方式一样培养和处理活病毒或蛋白质抗原。且由于不需要使用活病毒，减少了疫苗生产过程中的生物感染风险。由此可见，mRNA 疫苗是一种比较理想的疫苗类型。

利用 mRNA 研制疫苗的思路是：确定病原体关键蛋白（如新冠病毒刺突蛋白），以此为依据推测其编码基因的序列并体外合成关键蛋白的 mRNA，把合成的mRNA注入人体，让mRNA指导人体 细胞合成刺突蛋白，并引发人体的免疫应答。 

推测其编码基因的序列 通过生物信息学比较不同物种或毒株的病原体，找出高度保守的蛋白质或序列；或者通过免疫筛查找出诱导强烈免疫应答的病原体蛋白质；通过共沉淀、酵母双杂交、亲和纯化等经典的生化实验操作，找出在感染过程中起关键作用的病原体蛋白。 

找出病原体侵染的关键蛋白（抗原决定簇） 后，通过乙酸纤维电泳、质谱法、核磁共振法等对蛋白质进行鉴定，确定其氨基酸序列。然后，使用 Basic Local Alignment Search Tool（BLAST）在 Gen Bank 或其他相关的生物信息学数据库中对蛋白质序列进行搜索，找出与蛋白质序列高度相似的已知序列，从而推测这些序列对应的病毒基因序列。

体外合成 mRNA 的技术，通常称为体外转录（in vitro transcription， IVT）。对于 RNA 病毒，先提取总 RNA，逆转录形 成 DNA，再使用 DNA 模板生成 mRNA，具体流程为：DNA 模板准备—转录反应—在 mRNA 上加帽和加尾—RNA 纯化。

 1）DNA 模板准备。DNA 模板通常为线性化的质粒，含有所需的 mRNA 序列及一个能被 RNA 聚合酶识别的启动子，通过聚合酶链式反应（PCR）将 DNA模板准备好，为下一步的转录反应奠定基础。 

2）转录反应 。将 DNA 模板、三磷酸核苷 （NTPs）、RNA 聚合酶（如 T7、T3 或 SP6 RNA 聚合酶，取决于启动子的类型）、缓冲液及其他必要的因子等混合，利用 RNA 聚合酶进行体外转录，得到 mRNA 分子。

 3）在 mRNA 上加帽和加尾。在转录完成后或与转录同时，在反应体系中添加加帽酶（capping enzyme）和适当的供体分子（如 GTP 或甲基化的 GTP），形成 5′端的帽子结构；同时，使用多聚 A 聚合酶添加 poly（A）尾，形成 3′端的多聚腺苷酸尾， 即可获得成熟的 mRNA。 

4）RNA 纯化。转录后，由于新合成的 mRNA 含有未掺入的 NTPs、DNA 模板和其他杂质，需要通过一定手段去除，从而得到纯化的 mRNA。 

外源合成的 mRNA 被注射到体内后，会通过体液运输，进入巨噬细胞等抗原呈递细胞（APCs）。之后，mRNA 在抗原呈递细胞内部表达出相应的病原体蛋白，并呈递到细胞表面，激活辅助性 T 细胞，进而激活 T 细胞和 B 细胞，使得 B 细胞产生相关抗体，细胞毒性 T 细胞裂解被抗原侵染的细胞。mRNA 疫苗的工作机制如图 1 所示。

此过程中面临 3 个重要的科学问题：外源 mRNA 进入细胞中能否指导蛋白质的翻译？外源 mRNA 诱发人体先天免疫系统从而导致严重的细胞炎症反应怎么解决？mRNA 在运输过程中容易被降解怎么解决？下文分别对这 3 个问题进行阐述。 

2.3.1 外源 mRNA 进入细胞后能否作为模板指导翻译 

经由细胞核转录形成的内源 mRNA 可以翻译形成蛋白质，外源 mRNA 进到人体细胞中后，能否指导细胞内形成蛋白质？1990 年，威斯康星大学一个研究团队，将 mRNA 注射到小鼠体 内，并检测到了相应的蛋白表达。1992 年，另 一个研究团队在大鼠中进一步证明，体外注入的 mRNA 表达出的蛋白质还具有生理活性。这意味着外源合成的 mRNA 进入细胞后仍旧可以指导细胞合成蛋白质（如刺突蛋白），因此，mRNA 可以作为抗原激发人体产生免疫反应，从而起到疫苗的作用。 

2.3.2 外源 mRNA 导致细胞炎症的解决方法 

尽管外源 mRNA 可以指导细胞内蛋白质的形成，但是其本身作为一种外来物质，可以被机体识别，诱发细胞的先天免疫系统活化，从而使外源 mRNA 降解而无法翻译为抗原蛋白分子，也无法 引起有效的免疫保护。如何防止 mRNA 被人体识别？ 

考里科和魏斯曼发现，外源 RNA 会被 Toll like receptor（TLR）识别。而之所以会被识别，是因为外源 RNA 与哺乳动物内源 RNA 不同，缺乏某些修饰，这种修饰的区别体现为：哺乳动物中的 RNA 中具有假尿苷，被称为第 5 种核苷酸，但体外合成的外源 RNA 没有假尿苷的修饰。因此，外源 RNA 由于缺乏假尿苷的修饰会被机体免疫系统识别，从而导致炎症反应。于是，考里科和魏斯曼把外源 mRNA 上的尿苷替换成了假尿苷，外源 mRNA不再产生严重炎症反应，因此，解决了 mRNA 在人体内应用的安全性问题。 

考里科等还做了后续实验，去除了双链 RNA 对 mRNA 进行的纯化，不仅减少了细胞内炎症的发生，而且增加了翻译的效率，提高了 mRNA 的应用效率。 

2.3.3 mRNA 在运输过程中容易被降解的解决方法 

 mRNA 非常容易被降解，尚未被运输到相关细胞内作为模板指导翻译形成抗原蛋白分子之前，就有可能被降解。该如何解决？研究员构建出一个脂质纳米颗粒运载系统 LNP（lipid nanoparticles）（图 2），修饰后的 mRNA 由脂质纳米颗粒载体递送到人体细胞中，能避免 mRNA 被机体分解，并且能够刺激免疫系统产生抗体，中和入侵的病毒，该方法比完全依赖免疫系统本身效果更好。

研发 LNP 并非易事。普通的脂质体（liposome） 能沿着肿瘤附近的破碎血管进入细胞，帮助运输癌症药物，但结构简单的普通脂质体为中性或略带负电荷，这使得其很难有效地与带负电的酸性 DNA 或 RNA 结合。科学家设想，给脂质体添加带 有正电荷的脂质，可以与带有负电荷的核酸形成稳定平衡。使用永久带有正电荷的人造脂质会带来巨大的毒性，因为这些脂质会破坏细胞膜结构。如何解决这个问题？科学家的策略是使用可电离的脂质，让其在特定的条件下（如酸性环境），短暂携带正电荷，这样就能与核酸结合，将 RNA 包裹在其中，进行投递。 

综上所述，考里科和魏斯曼的工作解决了 mRNA 作为疫苗的稳定性差（稳定性）、体内效率低下（有效性）和激发机体先天免疫系统（安全性）的问题，使人工合成的 mRNA 能够安全地注射到人类细胞内，为疫苗研发作出了突出贡献。mRNA 新冠病毒疫苗的成功，让科研人员开始寻求包括流感、诺如病毒、疟疾、肺结核、登革热、寨卡病毒、艾滋病等各种疾病的 mRNA 疗法。同时， mRNA 疗法的研究还扩大到了其他领域，例如，治疗一些癌症、食物和环境过敏以及自身免疫病，相信 mRNA 疫苗和 mRNA 疗法在未来具有广阔的应用前景。